54例復治利福平耐藥結核病患者菌株遺傳特征及耐多藥基因分析

張潔，任怡宣，楊新宇，田麗麗，易俊莉，丁北川

北京市疾病預防控制中心，北京 100013

復治結核病患者較初治患者的病情更復雜、依從性更差、并發癥更多，通常需要更長時間才能完成治療方案，導致治療成功率較低，進一步加劇了結核分枝桿菌（MTB）的傳播。復治結核病是由兩種不同的機制引起的，一是感染后經過較長時間潛伏再發病，是由相同的MTB引起的內源性復燃，二是由近期傳播的不同MTB引起的外源性再感染［1］。耐藥結核病是威脅結核病控制的又一個重要問題，尤其是利福平耐藥結核病（RR-TB），而RR-TB常合并異煙肼耐藥導致耐多藥。2023年世界衛生組織估算，中國耐多藥/利福平耐藥結核病（MDR/RR-TB）患者數量達3萬例，結核病新發病例和復治病例的利福平耐藥率分別約為3%、20%［2］。但是，目前關于復治RR-TB患者的發病原因尚不清楚。本研究通過比較復治RR-TB患者分離MTB與其初治時分離MTB的基因型，從而判斷其復治的發病原因，再分析復治RR-TB患者MTB的遺傳特征和耐多藥突變位點情況，為復治RR-TB患者的有效防治提供科學依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 在北京市疾病預防控制中心信息系統查詢2017年1月—2019年12月北京市結核病防治機構及結核病定點醫院收治的復治RRTB患者登記信息，疾控中心樣本庫中需同時留存有其初治及復治MTB，選擇符合標準的復治RRTB患者54例，其中男45例、女9例，平均年齡46歲。本研究通過北京市疾病預防控制中心倫理委員會審核（JKS2020-02），患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 初治和復治分離的MTB基因型檢測 共獲得MTB 54對，初治和復治時分離的MTB各54株。①RD105基因缺失法：取PCR反應管，每管加入RD105 PCR MIX 19 μL，MTB DNA模板1 μL，混勻后進行PCR擴增。取PCR擴增產物5 μL，行2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker確定其分子相對量；若目的片段為786 bp，則該菌株為北京基因型。②15位點可變數目串聯重復序列（MIRU-VNTR）基因分型實驗：取PCR反應管15個，每個PCR管中分別加入15個基因位點（ETRA、ETRC、MIRU04、MIRU10、MIRU16、MIRU31、Mtub21、Mtub04、QUB11b、QUB26、QUB4156、MIRU26、MIRU40、Mtub30、Mtub39）的PCR MIX 19 μL，加入MTB DNA模板1 μL，混勻后進行擴增。取PCR擴增產物5 μL，行2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker確定其相對分子量，凝膠分析軟件分析條帶灰度值。根據各VNTR位點重復單元讀數表和讀數規則，計算各菌株在不同位點的重復數，將凝膠電泳結果轉化成具體數字，數字相同則為相同基因型，數字不同則為不同基因型。相同基因型提示為內源性復燃，不同基因型提示為外源性再感染。

1.3 復治MTB的遺傳特征分析 將“1.2”復治時分離的MTB MIRU-VNTR基因分型實驗結果導入https：//miru-vntrplus.org網站，構建個體水平N-J樹和UPGMA系統發育樹，進行聚類分析，構建最小生成樹（MST）。繪制病例之間的關聯圖，明確MTB在人群中的傳播情況。感染有相同基因型即具有“成簇性”，提示患者可能是近期被同一傳染源所感染。成簇率=（nc-n）/N × 100%，其中N是總的樣本數、nc是成簇樣本的數目、n是簇的數目；成簇率反映MTB在人群中的近期傳播水平。

1.4 復治MTB的耐多藥基因突變觀察 采用分子線性探針藥敏試驗。按照試劑盒說明書，將提取的復治MTB DNA用生物素標記，作為引物進行多重PCR擴增和反向雜交。雜交反應結束后，根據顯色結果進行判讀，每個探針試紙條上共有27個反應條帶。判讀標準：當一個基因的所有野生型探針（WT探針）都能被檢測到，并且在被檢測區域沒有檢測到突變時，WT探針條帶均顯色且突變條帶無顯色，該樣本被認為對相應的抗生素敏感；如果發生突變，各自的擴增產物不能結合到相應的WT探針，那么至少有1個WT探針條帶缺失，或者突變型探針（MUT探針）條帶顯色，則該樣本被認為是耐藥的。每個與野生型模式不同的帶型表示試驗菌株耐藥，用rpoB探針獲得的帶型可認為試驗菌株對利福平耐藥，用katG探針獲得的帶型可認為試驗菌株對高水平異煙肼耐藥，用inhA探針獲得的帶型可認為試驗菌株對低水平異煙肼耐藥。

2 結果

2.1 初治和復治分離的MTB基因型比較 RD105基因缺失法檢測結果顯示，108株MTB均為北京基因型；其中2株復治MTB擴增電泳后存在雙位點現象，重復兩次PCR后結果一致，提示為混合感染菌株，且均為北京基因型的相互混合，其初治分離MTB均為單一菌株。MIRU-VNTR基因分型實驗結果顯示，54對初治和復治分離的MTB中具有相同基因型42對，即復治RR-TB患者內源性復燃占比77.8%（42/54）；不同基因型12對（22.2%），即復治RR-TB患者外源性再感染占比22.2%（12/54）。

2.2 復治MTB的遺傳特征分析結果 個體水平N-J樹顯示，54株北京基因型菌株呈“放射狀”分布，提示這些菌株可能是由同一菌株進化而來，見OSID碼圖1。UPGMA系統發育樹見OSID碼圖2。MST顯示，所有菌株分為3個克隆復合群（CC1、CC2、CC3）和13個獨特基因型；其中CC1包括37株（68.5%）菌株，共32個基因型；CC2、CC3各包含2株菌株，均為不同的基因型，共4個基因型；13株獨特基因型菌株中，2株菌株成1個簇，共12個基因型；54株復治MTB共48種基因型，成簇率為11.1%；見OSID碼圖3。

2.3 復治MTB耐多藥基因突變情況 54株復治MTB中，34株rpoB基因S531L位點發生突變，表現為野生條帶WT8缺失、突變條帶MUT3出現；1株rpoB基因D516V位點發生突變；7株rpoB基因H526D位點發生突變；11株rpoB基因有野生條帶缺失，但沒有出現突變條帶，提示發生了不確定或未知的突變；1株rpoB基因在未缺失所有野生條帶的基礎上出現了1個突變條帶MUT1，提示異質性耐藥突變模式；見表1。54株復治MTB中，異煙肼耐藥katG、inhA基因突變40株，表示同時對異煙肼耐藥，即耐多藥率為74.1%（40/54）。40株耐多藥菌株中，katG基因S315T1位點發生突變30株（75%），提示異煙肼高水平耐藥；inhA基因C15T位點發生突變8株（20%），提示異煙肼低水平耐藥。2株katG基因突變菌株顯示野生條帶缺失但沒有突變條帶出現，提示有未知突變未被檢測到。

表1 復治MTB rpoB基因突變情況

3 討論

MTB耐藥主要是由基因靶點或其啟動子的特異耐藥決定區域或抗結核化療藥物的激活酶由于核苷酸取代、插入或刪除而引起的突變造成的［3］。利福平是一種關鍵的抗結核藥物，對MTB具有快速殺菌作用，被納入結核病的短期治療方案，可用于初治及復治結核病患者的治療。研究顯示，95%以上利福平耐藥是由rpoB基因突變引起的，常見于rpoB基因81 bp核心區域（RRDR），常見突變是密碼子531、526和516處氨基酸的改變［4］。泰國一項研究顯示其利福平耐藥菌株rpoB基因突變位點主要是Leu533Arg和Leu538Arg，而Val550Leu和Ser509Arg是中國研究發現的兩個新的利福平耐藥菌株rpoB基因突變位點，這提示MTB rpoB基因的單核苷酸具有多樣性［5-6］。本研究結果顯示，利福平耐藥菌株rpoB基因以S531L位點突變為主，與之前的相關研究結果一致［7］。當MTB對利福平產生耐藥性時，大多數患者也會發生異煙肼耐藥。研究顯示，利福平耐藥的結核病患者中有77.7%同時對異煙肼耐藥［8］。本研究結果顯示，復治RR-TB患者的耐多藥率為74.1%，與上述研究結果基本一致。

異煙肼耐藥的機制比利福平更加復雜，katG基因突變會導致其編碼的過氧化氫—過氧化物酶活性降低或喪失，從而阻止異煙肼轉換成活性形式，導致藥物失去作用，產生耐藥。另一方面，inhA基因突變可以造成異煙肼與NADH的親和力下降，而inhA啟動子區域突變會上調inhA基因表達，使得inhA蛋白過度表達；兩種突變導致MTB對異煙肼活性形式所需的濃度升高，最終因活性形式的異煙肼濃度不足而避免了對MTB的干擾，抑制了其抗菌效果［9］。檢測編碼過氧化氫酶的katG基因可以確定MTB對異煙肼的高水平耐藥，而檢測編碼NADH烯酰酸性磷酸酶還原酶的inhA基因啟動子區可以確定MTB對異煙肼的低水平耐藥。本研究結果顯示，導致復治RR-TB患者異煙肼耐藥的最常見突變是katG中的S315T位點發生突變（75%），與復治RR-TB患者高水平耐藥有關。了解katG和inhA基因突變的基本情況，可以指導臨床大夫更加合理用藥。對于僅發生inhA突變的患者來說，可以用高劑量異煙肼來進行治療，而當僅存在katG突變時，乙硫酰胺可能是一種更合適的治療方案［10］。

在很長一段時間內，臨床認為結核病是由于感染單一MTB而發生的，該病復發是由于患者免疫低下或缺陷導致體內菌株再激活的結果。隨著分子生物學技術的發展，基因分型方法在研究MTB的遺傳特性方面發揮了巨大的作用。基因分型研究結果顯示，不同來源MTB的外源性再感染也是結核病復發的原因，先前的感染不一定能能對之后的感染起保護作用［11］。因此，復治RR-TB可能是由于最近感染了新的菌株，也可能是由于體內菌株發展后再復燃引起的。研究復治RR-TB患者的發病原因，對于制定有效的防治措施具有重要的意義，如果是由內源性復燃引起的，那么應該重點對患者進行規范化治療和管理；如果是由其他菌株傳播導致的外源性再感染，那么及時發現傳染源，切斷傳播途徑是必要的防控手段［12］。本研究使用15 位點MIRU-VNTR基因分型實驗對54對復治RR-TB配對菌株進行分析，結果顯示77.8%的患者是由內源性復燃引起的，22.2%是因為傳播導致的外源性再感染。考慮目前復治RR-TB患者治愈率低，非有效治療的情況比較嚴重，因此提倡復治RR-TB患者住院隔離治療，可有效管理患者并督導其規律服藥，提高其治愈率的同時可以有效控制傳染源。

MTB有很多不同的菌型，北京基因型是存在最廣泛的。MTB RD105基因總長3 467 bp，包含Rv0072、Rv0073所有基因缺失及Rv0071、Rv0074部分基因缺失［13］。RD105基因缺失是北京基因型所特有的，在非北京基因型中并不常見。因此，RD105基因缺失可以作為鑒定北京基因型菌株的分子標志。本研究對復治RR-TB患者的臨床分離株進行鑒定，所有菌株為北京基因型。北京基因型具有獨特的特性，可以擺脫卡介苗疫苗的保護作用，從而進行有效傳播，這是其分布廣泛的重要原因［14-15］。研究認為，北京基因型菌株更容易發展成耐多藥菌株［16］。但也有研究表明，北京基因型菌株并不比非北京基因型菌株更容易耐藥，其與耐藥的關聯并不是因為突變增加或獲得耐藥的風險增加，而是由于耐藥的北京基因型菌株的傳播［17］。北京基因型菌株容易適應當地宿主，導致該基因型在不同地區的系統發育多樣性。因此，北京基因型菌株與耐藥的關聯可能只是反映了當地結核病的流行，而不是北京基因型菌株的固有特性。本研究結果顯示，北京地區復治RR-TB患者菌株成簇率為11.1%，低于全國5個地區的結核病平均近期傳播水平［18］。

綜上所述，北京地區復治RR-TB患者發病原因主要是內源性復燃，主要流行菌株為北京基因型，呈現出較高的遺傳多樣性，成簇率較低，MTB耐多藥基因突變位點多為rpoB基因S531L及katG基因S315T1。分子診斷技術的發展為及早發現耐藥結核病患者、發現傳染源、明確傳播關系奠定了基礎，臨床上應積極推廣該技術的應用。