消皮素B在人主動脈夾層組織中的表達變化及對主動脈平滑肌細胞焦亡、炎癥反應的影響

沈小艷，謝孝平，李博文，王志維

武漢大學人民醫院心血管外科，武漢 430060

主動脈夾層是一種十分危急的主動脈疾病，在未得到及時治療的情況下病死率極高。目前，主動脈夾層的治療方法主要是開放手術和介入治療，但由于手術難度大、治療時機晚、病損區域常累及內臟動脈，手術成功率和術后存活率均較低［1］。因此，深入研究主動脈夾層發生的病理生理機制，尋找相關治療靶點對于改善患者預后具有重要意義。細胞焦亡是新發現的一種細胞程序性死亡方式，消皮素（GSDM）蛋白家族成員可以通過介導細胞焦亡、釋放炎癥因子、調節炎癥反應等機制，參與多種炎癥疾病的發生發展［2-3］。消皮素B（GSDMB）是GSDM蛋白家族成員之一，在細胞焦亡和炎癥反應中同樣發揮重要作用。研究表明，GSDMB蛋白與半胱氨酸蛋白酶4（Caspase-4）結合可增強Caspase-4的活性，促進消皮素D（GSDMD）裂解為N-消皮素D（N-GSDMD），而GSDMD和N-GSDMD相關信號通路可直接參與細胞焦亡的調控，在非典型細胞焦亡過程中發揮關鍵作用［4］。目前，關于GSDMB在主動脈夾層組織中的表達變化，以及GSDMB沉默或過表達對人主動脈平滑肌細胞（HASMCs）焦亡和炎癥反應的影響鮮見報道，為此我們于2023年5月—11月進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入標準：①經主動脈計算機斷層掃描血管造影（CTA）檢查提示急性斯坦福A型主動脈夾層；②擬行升主動脈置換術。排除合并遺傳性胸主動脈疾病者，如馬凡綜合征、洛伊—迪茨綜合征及先天性結締組織發育不全綜合征等。選擇2017年1月—2020年12月武漢大學人民醫院收治并符合上述標準的主動脈夾層患者8例，男6例、女2例，年齡（55.2 ± 6.5）歲，術中收集其主動脈夾層組織8例份。選擇捐獻心臟的腦死亡患者8例，主動脈CTA檢查提示主動脈無病變，男6例、女2例，年齡（51.6 ± 5.8）歲，收集其主動脈組織8例份作為正常對照組織。主動脈夾層患者與捐獻者性別構成比、年齡均具有可比性（P均＞0.05）。本研究已經通過武漢大學人民醫院人類研究倫理委員會批準（WDRY2020-K230），患者及捐獻者家屬均簽署知情同意書。

1.2 實驗材料 細胞：HASMCs購自武漢普諾賽生命科技有限公司。主要試劑：DMEM高糖培養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司，LipofectamineTM3000試劑購自美國Thermo Fisher公司，細胞焦亡相關指標（GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）和內參GAPDH一抗購自武漢三鷹生物技術有限公司，炎癥因子白細胞介素18（IL-18）、白細胞介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒均購自泉州樂達啟博生物科技有限公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自武漢塞維爾生物有限公司；NC-siRNA和GSDMB-siRNA均由上海生工有限公司合成，空白載體質粒和GSDMB過表達質粒均購自武漢淼靈生物有限公司。

1.3 主動脈夾層組織與正常對照組織GSDMB蛋白檢測 采用Western blotting法。取主動脈夾層組織和正常對照組織，使用組織勻漿機在低溫條件下進行研磨，在4 ℃條件下高速離心，分離出蛋白質上清液。將提取的蛋白與上樣緩沖液按照1∶ 4的比例混合，100 ℃加熱10 min使蛋白變性。將蛋白樣本加載到聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上，依次進行電泳濃縮和分離，將蛋白從凝膠轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。加入5%脫脂牛奶封閉2 h，加入GSDMB及內參GAPDH一抗孵育過夜，加入使用HRP標記的二抗，孵育1 h。加入ECL化學發光劑進行顯影，Image J軟件分析條帶灰度值，計算GSDMB蛋白相對表達量。

1.4 GSDMB基因沉默對HASMCs焦亡和炎癥反應的影響觀察

1.4.1 細胞培養、分組及轉染 將HASMCs置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中，使用含有10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養基進行培養。待HASMCs處于對數生長期時，分為NC-siRNA組、脂多糖（LPS）組、GSDMB-siRNA組、GSDMB-siRNA+LPS組。LPS組和GSDMB-siRNA+LPS組加入1 μg/mL LPS作用24 h，NC-siRNA組、GSDMB-siRNA組、GSDMB-siRNA+LPS組分別使用LipofectamineTM3000試劑轉染NC-siRNA、GSDMB-siRNA、NC-siRNA，轉染48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.4.2 細胞GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD、MMP-9、MMP-2蛋白檢測 采用Western blotting法。收集處理后的各組細胞，加入RIPA緩沖液裂解10 min，使用BCA試劑盒測定總蛋白濃度，加入上樣緩沖液混合并高溫變性。以GAPDH為內參，參照“1.3”檢測并計算目的蛋白相對表達量。

1.4.3 細胞焦亡情況觀察 采用流式細胞術。收集處理后的各組細胞，預冷的PBS洗滌后離心，加入Binding Buffer 100 μL 進行重懸。加入PI 5 μL，室溫避光孵育20 min。加入PBS 400 μL混勻，上流式細胞儀檢測細胞焦亡率。

1.4.4 細胞上清液IL-18、IL-1β檢測 采用ELISA法。收集處理后的各組細胞上清，1 000 r/min離心20 min。在預先包被IL-18和IL-1β捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，溫浴60 min并徹底洗滌。底物TMB溫浴15 min顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化為藍色，并在酸的作用下最終變為黃色。使用酶標儀檢測450 nm波長下的光密度（OD）值，計算IL-18、IL-1β水平。

1.5 GSDMB基因過表達對HASMCs焦亡和炎癥反應的影響觀察

1.5.1 細胞培養、分組及轉染 將HASMCs置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中，使用含有10%胎牛血清、1%雙抗的高糖DMEM培養基進行培養。待HASMCs處于對數生長期時，分為空載質粒組、LPS作用組、GSDMB過表達組、GSDMB過表達+LPS組。LPS作用組和GSDMB過表達+LPS組加入1 μg/mL LPS作用24 h，空載質粒組、GSDMB過表達組、GSDMB過表達+LPS組分別使用LipofectamineTM3000轉染試劑轉染空載質粒、GSDMB過表達質粒、GSDMB過表達質粒，轉染48 h后收集細胞進行后續實驗。

1.5.2 細胞GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD、MMP-9、MMP-2蛋白檢測 參照“1.4.2”采用Western blotting法檢測各目的蛋白相對表達量。

1.5.3 細胞焦亡檢測 參照“1.4.3”采用流式細胞術檢測細胞焦亡率。

1.5.4 細胞上清液IL-18、IL-1β檢測 參照“1.4.4”采用ELISA法檢測細胞上清液IL-18、IL-1β水平。

1.6 統計學方法 采用Graphpad9.0統計軟件。計量資料采用S-W法檢驗正態性，呈正態分布以±s表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，重復測量數據采用重復測量的方差分析；非正態分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 主動脈夾層組織與正常對照組織GSDMB蛋白表達比較 主動脈夾層組織與正常對照組織GSDMB蛋白相對表達量分別為0.88 ± 0.16、0.62 ± 0.15，二者比較P＜0.05。

2.2 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組焦亡相關指標比較 見表1。

表1 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組焦亡相關指標比較（± s）

表1 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組焦亡相關指標比較（± s）

注：與NC-siRNA組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與GSDMB-siRNA組比較，△P＜0.05。

組別NC-siRNA組LPS組GSDMB-siRNA組GSDMB-siRNA+LPS組細胞焦亡率（%）11.17 ± 1.35 63.07 ± 4.27*11.73 ± 1.73#41.27 ± 2.22*#△GSDMB 0.73 ± 0.12 1.17 ± 0.10*0.34 ± 0.05*#0.78 ± 0.10#△Caspase-4 0.59 ± 0.03 1.06 ± 0.06*0.68 ± 0.15#0.88 ± 0.03*#△GSDMD 0.59 ± 0.03 1.06 ± 0.08*0.67 ± 0.14#0.90 ± 0.02*#△N-GSDMD 0.69 ± 0.17 1.14 ± 0.14*0.75 ± 0.19#0.85 ± 0.08*#

2.3 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組炎癥反應相關指標比較見表2。

表2 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組炎癥反應相關指標比較（± s）

表2 NC-siRNA組、LPS組、GSDMB-siRNA組和GSDMB-siRNA+LPS組炎癥反應相關指標比較（± s）

注：與NC-siRNA組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與GSDMB-siRNA組比較，△P＜0.05。

組別NC-siRNA組LPS組GSDMB-siRNA組GSDMB-siRNA+LPS組IL-1β（pg/mL）105.30 ± 8.62 285.70 ± 7.02*110.30 ± 5.51#184.00 ± 9.00*#△MMP-9 0.62 ± 0.10 1.07 ± 0.16*0.61 ± 0.10#0.78 ± 0.02#MMP-2 0.60 ± 0.04 1.02 ± 0.04*0.52 ± 0.07#0.54 ± 0.05#IL-18（pg/mL）205.70 ± 16.04 411.00 ± 12.12*213.70 ± 14.29#290.30 ± 19.30*#△

2.4 空載質粒組、LPS作用組、GSDMB過表達組和GSDMB過表達+LPS組焦亡相關指標比較 見表3。

表3 空載質粒組、LPS作用組、GSDMB過表達組和GSDMB過表達+LPS組焦亡相關指標比較（± s）

表3 空載質粒組、LPS作用組、GSDMB過表達組和GSDMB過表達+LPS組焦亡相關指標比較（± s）

注：與空載質粒組比較，*P＜0.05；與LPS作用組比較，#P＜0.05；與GSDMB過表達組比較，△P＜0.05。

組別空載質粒組LPS作用組GSDMB過表達組GSDMB過表達+LPS組細胞焦亡率（%）11.09 ± 1.27 58.94 ± 3.98*11.73 ± 1.47#76.99 ± 5.28*#△GSDMB 0.57 ± 0.03 0.71 ± 0.05*0.77 ± 0.04*0.98 ± 0.04*#△Caspase-4 0.62 ± 0.02 0.73 ± 0.04*0.64 ± 0.07#0.89 ± 0.05*#△GSDMD 0.72 ± 0.03 0.83 ± 0.01*0.70 ± 0.02#1.08 ± 0.12*#△N-GSDMD 0.50 ± 0.02 0.73 ± 0.04*0.46 ± 0.05#0.99 ± 0.02*#△

2.5 空載質粒組、LPS作用組、GSDMB過表達組和GSDMB過表達+LPS組炎癥相關指標比較 見表4。

表4 空載質粒組、LPS作用組、GSDMB過表達組和GSDMB過表達+LPS組炎癥反應相關指標比較（± s）

表4 空載質粒組、LPS作用組、GSDMB過表達組和GSDMB過表達+LPS組炎癥反應相關指標比較（± s）

注：與空載質粒組比較，*P＜0.05；與LPS作用組比較，#P＜0.05；與GSDMB過表達組比較，△P＜0.05。

組別空載質粒組LPS作用組GSDMB過表達組GSDMB過表達+LPS組IL-1β（pg/mL）114.00 ± 7.55 271.70 ± 15.53*117.00 ± 8.00#327.30 ± 19.60*#△MMP-9 0.32 ± 0.02 0.59 ± 0.03*0.40 ± 0.16#0.86 ± 0.08*#△MMP-2 0.47 ± 0.04 0.58 ± 0.04*0.46 ± 0.04#0.94 ± 0.14*#△IL-18（pg/mL）211.70 ± 12.86 364.00 ± 16.09*209.00 ± 19.08#410.30 ± 13.05*#△

3 討論

主動脈夾層是一種致命性大血管疾病，其發病機制非常復雜，主動脈中層退行性變是其主要病理特征，表現為血管平滑肌細胞丟失，炎癥細胞浸潤和細胞外基質降解等［5］。當血管平滑肌細胞受到損傷、氧化應激及炎癥因子等刺激時，會激活凋亡、壞死性凋亡和焦亡等多種相關信號通路。血管平滑肌細胞焦亡是主動脈夾層的重要發病機制之一，脂聯素通過靶向上調miR-133a基因而抑制細胞焦亡和表型轉換，從而減輕主動脈夾層形成，其機制與抑制細胞焦亡經典信號通路NLRP3/Caspase-1/GSDMD及炎癥因子釋放有關［6］。GSDMD通過激活血管平滑肌細胞內質網應激C/EBP同源蛋白（CHOP）信號通路，促進鳥氨酸脫羧酶 1 （ODC1）表達及提高腐胺水平，進一步加劇平滑肌細胞炎癥反應［7］。但是，GSDM家族成員GSDMB與主動脈夾層及血管平滑肌細胞的關系鮮見報道。

GSDMB是一種GSDM蛋白，是細胞焦亡的關鍵效應分子之一，具有調節免疫應答和炎癥反應等功能［8］。GSDMB的獨特之處在于其可以被特定的病原體感染，或被細胞內的應激反應所激活。一旦被激活，GSDMB能促進細胞膜破裂，導致細胞內容物泄露，包括促炎癥細胞因子。因此，GSDMB異常表達或活化可能導致過度炎癥反應，進而加劇疾病的嚴重程度［9-10］。本研究結果顯示，主動脈夾層組織GSDMB蛋白相對表達量高于正常對照組織；HASMCs經LPS作用后GSDMB、Caspase-4、GSDMD、N-GSDMD蛋白相對表達量及細胞焦亡率均升高，提示成功使用LPS構建HASMCs焦亡模型；該模型轉染GSDMB-siRNA后上述指標降低，轉染GSDMB過表達質粒后上述指標升高，提示敲低GSDMB表達可抑制LPS誘導的HASMCs焦亡，而過表達GSDMB會加重LPS誘導的HASMCs焦亡。

研究顯示，GSDMB還可以通過激活Caspase-4，釋放IL-18和IL-1β等炎癥因子，從而加重炎癥反應［11］。本研究結果顯示，HASMCs經LPS作用后MMP-9、MMP-2蛋白相對表達量及細胞上清液IL-18、IL-1β水平均升高，提示LPS可刺激HASMCs分泌炎癥因子；該模型轉染GSDMB-siRNA后上述指標降低，轉染GSDMB過表達質粒后上述指標升高，提示敲低GSDMB表達可抑制LPS誘導的HASMCs炎癥因子釋放，過表達GSDMB表達可促進LPS誘導的HASMCs炎癥因子釋放。研究發現，炎癥因子IL-18、IL-1β均能促進MMP-9、MMP-2分泌，而MMP-9、MMP-2可通過降解細胞外基質，促進主動脈壁彈性纖維破裂，從而加速主動脈夾層的形成［12-13］。研究顯示，A型主動脈夾層患者血清IL-1β水平升高，可通過促進MMP-9表達，增加主動脈夾層破裂的發生風險［14］。此外，IL-1β可通過促進胸主動脈夾層小鼠組織MMP-2和MMP-9表達，改變其主動脈壁功能，在胸主動脈夾層的形成中發揮關鍵作用［15］。因此，我們猜想GSDMB除了參與調控細胞焦亡以外，其釋放的炎癥因子可能進一步影響HASMCs分泌MMP-2和MMP-9。但是本研究中GSDMB-siRNA組僅GSDMB蛋白相對表達量低于NC-siRNA組，GSDMB過表達組僅GSDMB蛋白相對表達量高于空載質粒組，其他焦亡及炎癥相關指標沒有明顯改變，提示GSDMB沉默或過表達并不會誘導正常HASMCs發生焦亡或炎癥反應。這可能與在未受到LPS作用時GSDMB的N端結構域被C端結構域抑制，無法形成孔道有關［10］。

綜上所述，人主動脈夾層組織GSDMB表達升高；GSDMB不會影響正常HASMCs的焦亡和炎癥反應，但會通過Caspase-4介導的非經典途徑正向調控LPS誘導的HASMCs細胞焦亡和炎癥反應。因此，GSDMB是調控HASMCs焦亡和炎癥反應非經典途徑的關鍵分子，為主動脈夾層的治療提供了新靶點。