一株雞源糞腸球菌的分離鑒定

陳松，馬啟超，鮑佳茵，潘保革，許利軍，劉華格，王學靜,★，陳立功★

（1.河北農業大學動物醫學院，河北保定 071001；2.保定市畜牧工作站，河北保定 071001；3.河北省畜牧獸醫研究所，河北保定 071001）

近年來河北部分地區肉雞關節囊腫病發病率有逐漸增多的趨勢， 患病肉雞飼料利用率下降，淘汰率增高，給肉雞養殖造成了較大的經濟損失。 肉雞腿病的發病原因很多，其中細菌感染是主要原因之一。 肉雞關節囊腫中分離的細菌包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌，但尚無關于分離糞腸球菌的報道。 通常認為，細菌所攜帶的毒力因子在疾病發生過程中起著至關重要的作用，已報道的糞腸球菌毒力因子主要包括溶血素（cyl）、表面蛋白（esp）、明膠酶E（gelE）、聚集物質（asal）、心內膜炎抗原（efaA）、膠原蛋白黏附素（ace）、透明質酸（Hyl）。 筆者自保定某雞場患關節囊腫肉雞的關節液中分離鑒定到一株糞腸球菌，該結果可為肉雞關節囊腫的防控提供基礎。

1 材料與方法

1.1 生物材料

于2022 年6 月從保定某雞場采集肉雞關節囊腫液；糞腸球菌質控菌（BNCC 102668）購自北京北納創聯生物技術研究院。 BALB/c 小鼠購于河北伊維沃生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

甘露醇氯化鈉培養基、 胰蛋白胨大豆肉湯購自北京奧博星生物技術有限責任公司；革蘭氏染色液購自山東康華生物醫療科技股份有限公司；DL2000 DNA Marker、Premix TaqTM購自寶生物工程（大連）有限公司；快速DNA 提取檢測試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；50×TAE緩沖液、瓊脂糖購自索萊寶科技（北京）有限公司。

1.3 細菌分離鑒定

1.3.1 細菌分離純化與染色鏡檢

2 毫升胰蛋白胨大豆肉湯與500 微升肉雞關節囊腫液混合， 置37℃震蕩培養24 小時；取肉湯培養物在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上分區劃線，瓊脂平板置于37℃培養18～36 小時；挑取單個菌落在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上再次純化。判定已純化的細菌進行革蘭氏染色、鏡檢、拍照。

1.3.2 細菌16S rDNA 遺傳進化分析

擴增細菌16S rDNA 的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴增片段大小為1400bp。 用快速DNA 提取檢測試劑盒提取分離純化的細菌DNA。 PCR 擴增體系依照快速DNA提取檢測試劑盒進行， 擴增程序：95℃預變性5分鐘；95℃變性30 秒，55℃退火30 秒，72℃延伸1 分鐘，30 個循環；72℃終延伸10 分鐘。

PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR 陽性產物測序結果進行BLAST 比對。 應用DNAStar 分析軟件對分離細菌的16S rDNA 基因序列與9 株糞腸球菌參考菌株 （基因登錄號ON778619.1、OP359300.1、OP359284.1、OQ405977.1、KJ726743.1、KP317676.1、OQ406010.1、OQ405593.1、MT604811.1） 進行同源性分析； 基于細菌的16S rDNA 基因序列，用MEGA7 軟件繪制遺傳進化發生樹， 并進行遺傳進化分析。

1.3.3 細菌毒力基因檢測

參照文獻設計8 對糞腸球菌毒力基因（ace、asal、gelE、efaA、cylA、hyl、Agg、esp） 以上引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。 PCR 擴增體系同上。 擴增程序：56℃退火，其余同上。

1.3.4 動物回歸試驗

將30 只SPF 雞隨機分成a、b 兩組，每組15只。使菌液濃度達到每毫升樣品中含有1×108的細菌群落。 a 組經跗關節注射1 毫升糞腸球菌，b組經跗關節注射1 毫升滅菌生理鹽水。 分別隔離飼養觀察42 天。 接種后每天觀察記錄SPF 雞的死亡情況及跗關節處是否有腫脹， 死亡SPF雞及時進行病理剖檢及細菌分離培養，同時將b組雞進行剖檢及細菌分離培養。

2 結果

2.1 細菌分離純化及染色結果

自保定某雞場采集的肉雞關節囊腫液中分離純化1 株細菌 （命名為HBBDYX E.faecalis株）。 HBBDYX E.faecalis 株分離菌在甘露醇氯化鈉瓊脂平板上生長呈淺粉色、邊緣整齊、圓形的小菌落，光鏡下該細菌呈革蘭氏陽性、短鏈狀球菌。

2.2 細菌16S rDNA 鑒定結果

HBBDYX E.faecalis 株分離菌的PCR 擴增產物電泳可見大小約為1400bp的目的條帶 （圖1）；HBBDYX E.faecalis 株分離菌16S rDNA 序列與糞腸球菌參考株（ON778619.1）的同 源 性 達99.9%。遺傳進化分析結果（圖2）表明，HBBDYX E.faecalis 株分離菌與糞腸球菌參考株（ON778619.1）親緣關系最近，因此判定該分離菌屬于糞腸球菌。

圖1 細菌16S rDNA PCR 產物電泳結果

圖2 基于16S rDNA 基因序列生成的遺傳進化樹

2.3 細菌毒力基因檢測結果

成功地擴增出了HBBDYX E.faecalis 株分離 菌 的ace 基 因、asal 基 因、gelE 基 因、efaA 基因； 但未檢出cylA 基因、hyl 基因、Agg 基因、esp基因（圖3）。

圖3 糞腸球菌毒力基因檢測結果

2.4 動物回歸試驗結果

a 組SPF 雞于接種后12 天發病， 表現精神沉郁（15/15）；接種后7 天、8 天、12 天分別死亡1 只，死亡率為20.00%（3/15）；接種后20 天跗關節見腫脹（1/12），到接種后42 天共有8 只雞見跗關節腫脹，跗關節腔發現大量白色黏液，病變率為66.67%（8/12）， 自a 組死亡雞和關節腫脹的雞均可回收到糞腸球菌。b 組雞觀察期內未見發病死亡，人工處死后均無肉眼可見病變，細菌分離結果呈陰性。

3 討論

糞腸球菌多分布于糞便、尿液中，但本研究自肉雞關節囊腫液中分離純化得到1 株糞腸球菌。 目前，國內對肉雞關節病中分離菌的報道多集中于葡萄球菌、大腸桿菌、沙門菌，未見分離到糞腸球菌的報道。本試驗從河北保定某肉雞養殖場患有關節囊腫的肉雞中分離到1 株糞腸球菌， 試驗結果表明該分離菌株攜帶4 種毒力基因， 且對SPF 雞具有致病性。 我國作為養禽大國，獸藥使用較多。 獸用的抗生素在禽病防治和提高養殖效益上十分重要。由于抗生素的使用不規范等原因導致細菌耐藥性增高，給禽病防治工作帶來了很大的難度。筆者后期擬繼續開展雞源糞腸球菌的分離鑒定及分離菌的耐藥性監測，以為肉雞關節囊腫的防治提供理論參考。