胰島素樣生長因子2基因在A型主動脈夾層組織中的表達研究

王海濤 蔣丁勝 方澤民

A型主動脈夾層(type A aortic dissection,TAAD)是一種心血管急危重癥,病人需要得到快速的診斷和治療[1]。目前,針對TAAD的治療方法主要依靠外科手術,缺乏行之有效的保守治療方案以及預防篩選方案。TAAD的發病機制涉及多種病理生理過程,且其中的分子機制尚未完全闡明。胰島素樣生長因子2(insulin like growth factor 2,IGF2)是系統發育過程中經典的胰島素/ IGF信號軸的組成部分,在調節細胞的生存、生長和增殖以及代謝方面均發揮重要作用[2]。IGF2表達的異常增多在乳腺癌、肝癌、肺癌等癌癥研究中均有報道[3],但IGF2在心血管疾病領域研究較少。本研究探討IGF2在TAAD中的表達情況及其臨床意義。

對象與方法

一、對象

2015年1月～2019年12月我院行升主動脈置換術的TAAD病人9例(夾層組)和心臟移植供體修剪下來主動脈5例(對照組),標本均取用升主動脈部分。納入標準:夾層組入院后行主動脈血管增強CT(CTA)確診為TAAD。排除標準:均排除合并馬凡綜合征、創傷性夾層、腫瘤、風濕性疾病、傳染性疾病等。本研究獲得我院倫理委員會批準并獲得知情同意書。

二、方法

1.術中所獲組織分生標本組立即切割為1.0 cm3的組織塊,并立即轉移至細胞凍存管中后經液氮速凍,-80 ℃冰箱中保存備用。病理標本放入4%甲醛溶液中室溫保存,經過脫水、固定、石蠟包埋等處理,并將主動脈壁病理標本切為5 μm厚的石蠟切片。

2.蘇木精-伊紅(HE)染色:切片脫蠟水合后經蘇木素染色,1%的鹽酸酒精分化,Scott液染色,伊紅染液染色。再將切片依次放入95%酒精Ⅰ ,95%酒精Ⅱ,無水乙醇Ⅰ ,無水乙醇Ⅱ,二甲苯Ⅰ ,二甲苯Ⅱ中脫水透明,最后將切片從二甲苯拿出來稍晾干,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察拍照。

3.彈性纖維(EVG)染色:將切片脫蠟水合后放入高錳酸鉀,接著放入Elastin染液中浸染過夜,再用95%乙醇浸泡2次。放入Van Gieson染液,后經梯度乙醇脫水,封片后顯微鏡下觀察拍照。

4.蛋白質免疫印跡法(Western Blot):取凍存的組織塊研磨后用現配制的裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解后超聲。將所得蛋白樣品使用BCA蛋白質定量試劑盒(Thermo Fisher scientific,23227)測定總蛋白質濃度。將蛋白質變性后每組蛋白樣品按20 μg進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉移到PVDF膜上,使用5%脫脂牛奶(5 g脫脂奶粉∶1 000 ml TBST)室溫封閉1小時后用TBST洗膜后置于含有相應一抗的抗體稀釋液(IGF2,1∶100,ATLAS,HPA007556)中于4 ℃冰箱孵育過夜。用TBST洗膜,然后使用相應二抗室溫孵育2小時,再次使用TBST洗膜。加入顯影液,使用Chemi Doc TMXRS+成像系統(BioRad)顯影成像,使用Image Lab軟件測定條帶中蛋白質的相對表達量。

5.免疫組化染色:切片脫蠟、水合后進行EDTA抗原修復。用3%的H2O2消除內源性過氧化物酶,PBS漂洗。滴加5%BSA封閉。去除BSA,滴加50 μl一抗(IGF2,1∶100,ATLAS,HPA007556),4 ℃孵育過夜后,PBS漂洗。滴加反應增強液37 ℃孵育,PBS漂洗。滴加二抗孵育,PBS洗3次。滴加現配DAB工作液染色,PBS漂洗。蘇木素復染、鹽酸酒精分化。切片脫水透明。中性樹脂封片,采集圖像,使用Image J軟件進行分析。

三、統計學分析

結果

1.HE染色:對照組主動脈結構完整,血管平滑肌細胞排列整齊,細胞呈長梭形,胞質豐富,細胞核深染;夾層組主動脈壁中平滑肌細胞皺縮且排列紊亂,胞核變小且胞質染色變淺,細胞形態發生改變并伴有數量的下降。見圖1A、B。

A 對照組 HE染色,可見主動脈壁結構規整,主動脈平滑肌細胞排列有序。B 夾層組,可見主動脈壁結構退變,主動脈平滑肌細胞排列紊亂。C 對照組,主動脈壁彈力纖維完整緊密。D 夾層組,主動脈壁彈力纖維斷裂、丟失

2.EVG染色:對照組主動脈中彈力纖維完整連續,排列緊密有序,夾層組主動脈壁中彈性纖維染色變淺,彈力纖維排列疏松,纖維變細且斷裂增加。見圖1C、D。

3.IGF2蛋白水平在主動脈夾層組織和正常組織中的差異表達:Western Blot檢測結果顯示,正常組織表達量為1.000±0.370,主動脈夾層組織中IGF2蛋白相對表達量(夾層組)為0.229±0.148),差異有統計學意義(P<0.05,圖2)。提示IGF2可能在維持主動脈正常的結構和功能方面發揮重要作用,而主動脈壁組織中如果缺乏IGF2,則可能導致主動脈的結構發生紊亂和功能發生異常,甚至導致夾層發生發展。

圖2 兩組主動脈壁組織中IGF2蛋白表達及定量(P<0.05)

IGF2陽性表達為棕色,可見A對照組中IGF2表達顯著高于B夾層組

4.免疫組化染色:IGF2主要在主動脈平滑肌細胞核中表達。對照組主動脈中可見大量平滑肌細胞核中深染的棕色顆粒(圖3),Image J統計顯示,對照組主動脈平滑肌細胞中IGF2相對表達量為13.87±1.21,夾層組為0.6167±0.210,兩組比較差異有統計學意義(P<0.05,圖3)。

討論

主動脈夾層的形成是由高血壓、遺傳因素等多種因素導致主動脈內膜破裂,血液進入主動脈中膜形成真假腔,假腔的形成隨時可能導致主動脈破裂危及病人的生命。關于主動脈夾層的病理機制,目前已知的主要包括平滑肌細胞丟失、細胞外基質紊亂、彈性纖維斷裂、炎癥細胞浸潤等[4]。血管平滑肌細胞的丟失,通常認為是與平滑肌細胞增殖、凋亡功能異常有關。IGFs在各種組織器官的生長促進中發揮著關鍵的自分泌、旁分泌和內分泌作用,調節細胞增殖、分化和凋亡[5]。IGF2是胰島素/IGF系統中的一部分,該系統由胰島素、IGFs、IGF受體(IGFRs)、IGF結合蛋白(IGFBPs)及相關蛋白酶組成[3]。IGF2在多種器官和組織中廣泛表達,并在組織中發揮特異性作用。有研究表明,IGF2在癌細胞中表達上調,可增強其生存和侵襲能力,主要通過結合IGF1R激活下游通路發揮生物學作用,促進細胞增殖,抑制細胞凋亡[6]。還有研究表明,IGF2可以增加參與血管生成的基因的表達,以此通過增加癌癥細胞的血液供應來促進腫瘤的生長和擴散[7]。雖然對IGF2與心血管疾病相關的研究有限,但一些研究表明,IGF2水平可能與CVD風險增加有關。

血管平滑肌細胞增殖維持主動脈壁內血管平滑肌的數量,可以起到保護作用并延緩主動脈瘤和主動脈夾層的發展[8]。IGF2可以促進動脈血管平滑肌細胞的生長和增殖,通過下調IGF2可以抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移[9]。IGF2通過與平滑肌細胞表面的IGFR1結合,激活了刺激細胞周期和促進細胞增殖的信號通路,增加參與細胞周期進展和DNA合成的基因的表達,促進細胞增殖。IGF2在血管生成中的作用也被揭示。尖端細胞是一種由促血管生成因子誘導的內皮細胞的轉導表型,在引導新生血管生成方面發揮重要作用。有研究發現,IGF2對維持尖端細胞十分重要[10]。IGF2的敲除通過抑制人臍靜脈內皮細胞的發芽,以及IGFBP3和IGFBP4通過對IGF2-IGFR1進行調控繼而影響新生血管的生成[11]。

細胞凋亡是程序性細胞死亡的過程,對組織器官的發育和維持正常結構至關重要。在主動脈夾層病人樣本中,促進凋亡的Bcl-2家族蛋白(Bax)上調,而抑制凋亡的Bcl-2家族蛋白(Bcl-2)下調,提示凋亡增強是主動脈夾層發生的重要過程[12]。IGF2在調節細胞凋亡中也發揮作用。有研究表明,IGF2通過抑制細胞凋亡來促進細胞存活。如在神經退行性疾病的動物模型中,IGF2已被證明可以通過激活PI3K/AKT/CREB信號通路保護海馬體免受細胞凋亡[13]。在癌癥細胞中,IGF2已被證明通過抑制凋亡來促進細胞存活和對化療的抵抗。有關IGF2 mRNA結合蛋白3(IGF2BP3)的研究顯示,在IGF2BP3敲除后,細胞IGF2蛋白減少且受輻射誘導的細胞凋亡增加,在將重組IGF2應用于培養物后恢復了細胞對凋亡的抵抗力[14]。敲低IGF2可以提高氧化低密度脂蛋白刺激的血管平滑肌細胞的細胞凋亡水平[15]。可見IGF2在抵抗細胞凋亡中發揮了重要作用。

本研究存在一定局限性。對照組來源于未患有主動脈疾病的心臟移植供體捐獻者,缺少主動脈CTA檢查結果,也缺少主動脈直徑相關數據。因此,未能進行IGF2表達量與主動脈直徑關系的相關分析。

本研究發現,IGF2在主動脈夾層病人主動脈壁組織中的表達量顯著降低,IGF2的下調可能減弱了平滑肌細胞的增殖能力,增加了平滑肌細胞凋亡,進而使得主動脈血管中層結構不能維持,最終引發主動脈夾層。但對于IGF2的調控機制,以及是否通過促進血管平滑肌細胞增殖或者抵抗平滑肌細胞凋亡發揮保護作用,仍需要進一步研究探討。IGF2經過深入地研究有望成為預防和治療主動脈夾層的靶點。

利益沖突 所有的作者聲明沒有利益沖突

作者貢獻 王海濤:標本收集、研究實施、文章撰寫;蔣丁勝:實驗設計、文章批閱;方澤民:標本收集、文章批閱、經費支持