原子力顯微鏡對牙釉質(zhì)脫礦再礦化的分析

郝麗英， 劉宇峰， 文鶯惠， 鄭賽男

（1.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔疾病防治全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；2.成都大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610106）

0 引 言

牙釉質(zhì)在有唾液存在的健康口腔環(huán)境中相對穩(wěn)定，但在以細(xì)菌為主的多因素作用下，牙釉質(zhì)的脫礦及再礦化作用在牙釉質(zhì)-牙菌斑-唾液界面不斷發(fā)生，出現(xiàn)脫礦與再礦化失衡，從而引起齲病的發(fā)生。此外，牙釉質(zhì)脫礦還會引起牙齒中鈣磷的損失［1］、牙釉質(zhì)表面結(jié)構(gòu)的脫礦［2］、牙齒顯微硬度的降低［3］以及牙齒的齲壞［4-5］。因此，牙釉質(zhì)的再礦化研究受到學(xué)者們的重視。再礦化定義為從口腔中獲得的鈣和磷離子沉積到脫礦的釉質(zhì)晶體空隙中，從而產(chǎn)生礦物質(zhì)累積的過程。鈣、磷離子從唾液和菌斑液中重新沉積在脫礦的病變部位，形成新的羥基磷灰石，這些晶體更大，更耐酸溶解［6］，從而更有效地保護(hù)牙齒。因此，對牙釉質(zhì)脫礦及再礦化分析尤為重要。目前，常用的牙釉質(zhì)脫礦及再礦化分析方法主要包括掃描電子顯微鏡（SEM）和顯微硬度分析。然而，SEM 測試需要對樣本進(jìn)行噴金的前處理且放大倍數(shù)有限，產(chǎn)生樣本無法再次利用、形貌變化指標(biāo)觀察不清等問題。同時(shí)，顯微硬度分析屬于宏觀指標(biāo)分析，無法進(jìn)行微觀定量分析。此外，牙釉質(zhì)脫礦還會引起細(xì)菌黏附，傳統(tǒng)的分析方法無法進(jìn)行黏附力的測試。因此，建立牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的分析實(shí)驗(yàn)尤為重要。

原子力顯微鏡（AFM）是一種觀察材料表面微觀形貌的精密儀器，通過測量樣品表面分子（原子）與AFM 微懸臂探針之間的相互作用力，觀測樣品表面形貌和力學(xué)性質(zhì)［7-8］。將一個(gè)對極微弱力極敏感的微懸臂一端固定，另一端有一微小的針尖，針尖與樣品表面輕輕接觸。由于針尖尖端原子與樣品表面原子間存在極微弱的排斥力，使得微懸臂發(fā)生形變或運(yùn)動(dòng)狀態(tài)發(fā)生變化。掃描時(shí)，傳感器檢測出這些變化，從而獲得作用力分布信息，然后通過控制／反饋系統(tǒng)，將作用力分布信息轉(zhuǎn)化成分辨率較高的樣品表面結(jié)構(gòu)信息［9］。依據(jù)AFM 測試原理，對樣本無須進(jìn)行前處理，樣本測試完后便可繼續(xù)下一步的實(shí)驗(yàn)研究。此外，AFM 不僅可以提供較SEM 放大倍數(shù)更高的微觀形貌，還可以提供相應(yīng)的粗糙度值，甚至可以進(jìn)行三維重建以及不同脫礦程度的細(xì)菌黏附力研究［10-11］。該技術(shù)不僅使得樣本的微觀形貌可視化，還可對粗糙度和細(xì)菌黏附力等進(jìn)行量化分析，為實(shí)驗(yàn)教學(xué)以及科學(xué)研究提供了重要的技術(shù)手段［12］。

以脫礦離體牙和再礦化牙釉質(zhì)為研究對象，通過原子力顯微技術(shù)進(jìn)行脫礦前后形貌差異的表征，并進(jìn)行三維重建及粗糙度量化，使得形貌變化更為直觀并附有量化信息。此外，采用口腔主要的致齲細(xì)菌變異鏈球菌（S.mutans）對AFM 探針進(jìn)行修飾，分析變異鏈球菌對牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的黏附力，建立牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的分析方法，拓展AFM的功能。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑：脫礦液，磷酸二氫鉀（KH2PO4）、氯化鉀（KCl）、氯化鈣（CaCl2）、N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）。以上均為分析純試劑，購自成都科龍?jiān)噭┕尽ＤX心浸液培養(yǎng)基（BHI）購于英國Oxoid Ltd.公司，營養(yǎng)瓊脂、蔗糖購于北京生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用水均為二次蒸餾水。輕敲模式探針型號為OMCL-AC240TS-C3，接觸模式探針型號為TL-CONT。

儀器：硬組織切割機(jī)（Struers Minitom，丹麥）、顯微硬度計(jì)（Struers Duramin-2，丹麥）、拋光機(jī)（Struters，丹麥）、超聲清洗機(jī)（Autoscience，美國）、AFM（SPM-9600，島津，日本）、場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Inspect F，F(xiàn)EI，美國）。

1.2 牙釉質(zhì)脫礦及再礦化實(shí)驗(yàn)

（1）牙釉質(zhì)收集。收集華西口腔醫(yī)院因正畸拔除的上下頜前磨牙15 顆，患者年齡在12 ～16 歲，無齲病，形態(tài)色澤正常，無明顯裂紋，釉質(zhì)發(fā)育良好，牙體健康，非氟斑牙和四環(huán)素牙。去除結(jié)石和軟組織，洗凈后放置在蒸餾水中，于4 ℃的冰箱內(nèi)保存。

（2）切片和包埋。所有標(biāo)本切除牙根，用鋸式切片機(jī)平行于前磨牙頰面并距頰面約2 mm 處低速切片，取得厚度為2 mm 的釉質(zhì)塊。每顆牙分成2 個(gè)牙塊，共30 個(gè)牙塊。配制一定比例的環(huán)氧樹脂膠，將分割好的牙塊包埋，備用。

（3）打磨。將包埋好的牙塊分別用400 目（目指1 in2面積內(nèi)網(wǎng)孔數(shù)）、800 目、1 000 目、1 400 目、1 800目、2 000 目、2 500 目、3 000 目的砂紙打磨，下底面水平即可，牙釉質(zhì)面要打磨平滑。在每個(gè)牙塊釉面處留有3 mm×3 mm 的開窗區(qū)，其余部分用指甲油封閉。

（4）牙釉質(zhì)脫礦實(shí)驗(yàn)。采用脫礦液進(jìn)行牙釉質(zhì)脫礦處理，隨機(jī)挑選包埋打磨好的27 個(gè)牙塊并隨機(jī)分成3 組，每組9 個(gè)樣本：A 組（對照組，不浸泡）、B 組（實(shí)驗(yàn)組，浸泡5 s）、C 組（實(shí)驗(yàn)組，浸泡15 s），處理完后將每個(gè)樣本均使用清水沖洗約20 s，然后自然干燥后備用。

（5）脫礦牙釉質(zhì)的再礦化實(shí)驗(yàn)。再礦化溶液配制：130 mmol／L KC1、1.5 mmol／L CaCl2、0.9 mmol／L KH2PO4、20 mmol／L HEPES，調(diào)節(jié)pH值至7.0［13］。

將上述3 組脫礦牙釉質(zhì)（27 個(gè)，9 個(gè)／組）按礦化液浸泡時(shí)間不同再分為3 組，每組3 個(gè)樣本：D 組（對照組，不浸泡）、E 組（實(shí)驗(yàn)組，浸泡3 d）、F 組（實(shí)驗(yàn)組，浸泡7 d）。浸泡完后用清水清洗干凈，自然干燥后備用。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)

變異鏈球菌由四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，按照細(xì)菌常規(guī)培養(yǎng)方法培養(yǎng)，獲得細(xì)菌混懸液，進(jìn)行探針的修飾［14］。

1.4 牙釉質(zhì)脫礦及再礦化分析

采用AFM對牙釉質(zhì)脫礦及再礦化進(jìn)行形貌和粗糙度分析，并采用顯微硬度計(jì)和場發(fā)射掃描電子顯微鏡對脫礦及再礦化牙釉質(zhì)的顯微硬度和形貌進(jìn)行驗(yàn)證分析。

1.5 牙釉質(zhì)脫礦及再礦化細(xì)菌黏附力分析

（1）探針制備［15］。采用無針尖探針，型號為TLCONT。將探針的懸臂梁尖端2／3 浸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的多聚賴氨酸中3 min，取出自然干燥5 min，使得探針表面帶有正電荷。將探針浸入制備好的變異鏈球菌懸液中，5 min后取出探針，自然晾干10 min，然后立即進(jìn)行黏附力測試。

（2）黏附力測試。將牙釉質(zhì)樣本固定于樣本臺上，對細(xì)菌修飾的探針采用接觸模式，在2 μm ×2 μm范圍、1 Hz頻率下進(jìn)行黏附力測試。每個(gè)樣本隨機(jī)選取7 個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)測量10 次。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

各組的粗糙度值表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較。對于黏附力，每個(gè)位點(diǎn)采用平均法計(jì)算，7 個(gè)位點(diǎn)的數(shù)據(jù)采用中位數(shù)計(jì)算法獲得最終的黏附力，最后采用Dunn’s 檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較分析。使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行各組差異比較分析，***p＜0.001 表示有極顯著差異，**p＜0.01 表示有非常顯著差異，*p＜0.05 表示有顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 AFM對牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的形貌分析

圖1 為牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的AFM 圖。正常牙釉質(zhì)的釉柱結(jié)構(gòu)［見圖1（a）］經(jīng)過酸蝕處理5 s［見圖1（d）］和15 s［見圖1（g）］后，釉質(zhì)表面損壞，呈現(xiàn)出鱗狀的顆粒結(jié)構(gòu)，表面凹凸不平，隨著酸蝕時(shí)間的增加，鱗狀顆粒越密，表面微觀形態(tài)越粗糙。經(jīng)再礦化液處理后［見圖1（e）、（f）、（h）、（i）］，釉質(zhì)上的微孔變少，表面有沉積物填充、覆蓋，表面變得平整；釉質(zhì)中大蜂窩孔消失，但仍有微孔存在，雖然釉面上礦物質(zhì)重結(jié)晶增多，但是致密感依然不如未脫礦的牙釉質(zhì)。隨著再礦化時(shí)間增長，釉質(zhì)表面更加平整、致密，覆蓋物更多。綜上表明，AFM可對牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的微觀形貌進(jìn)行分析。

圖1 牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的AFM圖

2.2 AFM對牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的量化分析

AFM可進(jìn)一步對牙釉質(zhì)的粗糙度進(jìn)行量化分析，為實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科學(xué)研究提供更直觀的數(shù)據(jù)支撐。如圖2（a）及表1 所示，隨著酸蝕時(shí)間的增加，粗糙度增大，且組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。如圖2（b）及表1 所示，隨著再礦化時(shí)間的增加，粗糙度呈現(xiàn)降低的趨勢，表明酸蝕時(shí)間越長，牙釉質(zhì)表面破壞程度越大，再礦化可以對牙釉質(zhì)表面有一定的修復(fù)作用，而且再礦化時(shí)間越長，對牙釉質(zhì)的修復(fù)效果越好。根據(jù)表2、3 的統(tǒng)計(jì)分析，相同脫礦時(shí)間下牙釉質(zhì)經(jīng)過不同時(shí)間的再礦化處理后，粗糙度兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；不同脫礦時(shí)間下牙釉質(zhì)經(jīng)過相同時(shí)間的再礦化處理后，粗糙度兩兩比較也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表1 不同脫礦處理的牙釉質(zhì)在不同再礦化時(shí)間下的粗糙度值

表3 不同再礦化時(shí)間下的牙釉質(zhì)表面粗糙度比較

2.3 SEM和顯微硬度測試對牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的驗(yàn)證

選用SEM對牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的形貌進(jìn)行表征。如圖3 所示，正常牙釉質(zhì)表面致密平整［見圖3（a）］，當(dāng)脫礦5 s后［見圖3（d）］，釉柱結(jié)構(gòu)被酸溶解，牙釉質(zhì)表面呈現(xiàn)疏松狀態(tài)，脫礦時(shí)間越長牙釉質(zhì)表面被酸溶解越嚴(yán)重［見圖3（g）］。當(dāng)脫礦牙釉質(zhì)經(jīng)過再礦化處理后，牙釉質(zhì)表面沉積一層絮狀礦物質(zhì)，表面變得平整、致密，并隨著再礦化時(shí)間的增加，牙釉質(zhì)表面變得更為平整、致密。脫礦牙釉質(zhì)在再礦化液處理下，再礦化液中鈣、磷離子累積所形成的羥基磷灰石晶體覆蓋于牙釉質(zhì)表面，使牙釉質(zhì)表面更加平整、致密。SEM 形貌表征結(jié)果與AFM 形貌表征結(jié)果一致，但是在SEM測試前需要對樣本進(jìn)行噴金處理，造成樣本無法重復(fù)利用，而且不能提供相應(yīng)的粗糙度值。

圖3 牙釉質(zhì)脫礦及再礦化后的SEM圖

此外，采用顯微硬度測試進(jìn)一步驗(yàn)證粗糙度。由不同時(shí)間脫礦后牙釉質(zhì)表面顯微硬度圖（見圖4）可見，脫礦5 s組［見圖4（b）］較脫礦0 s組［見圖4（a）］菱形圖案變大，脫礦15 s 組［見圖4（c）］菱形圖案更大。由圖4（d）的硬度值分析可知，隨著脫礦時(shí)間的增長，牙釉質(zhì)表面逐漸由緊致變得疏松，牙釉質(zhì)表面的顯微硬度也隨之降低。柱狀圖［見圖4（d）］分析表明，脫礦時(shí)間5 s組、脫礦時(shí)間15 s 組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**p＜0.01）。脫礦時(shí)間5 s 組和0 s 組相比，脫礦時(shí)間5 s組具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（***p＜0.001）。脫礦時(shí)間15 s 組顯微硬度更低，存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（***p＜0.001），表明脫礦后牙釉質(zhì)的釉柱和柱間質(zhì)流失，釉質(zhì)崩塌，硬度降低，脫礦時(shí)間越長牙釉質(zhì)表面顯微硬度越低，與AFM 的粗糙度分析結(jié)果一致。圖4中，1 VHN ＝9.807 MPa。

由表4 可知，隨著再礦化時(shí)間的增加，牙釉質(zhì)的形態(tài)逐漸由疏松變得緊致，牙釉質(zhì)表面的顯微硬度也隨之升高。由圖5 和表5、6 可知，在相同的脫礦時(shí)間下，再礦化3 d和7 d組較未再礦化組均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，再礦化時(shí)間越長差異越大，表明再礦化液對脫礦后牙釉質(zhì)的表面顯微硬度有一定的恢復(fù)效果，再礦化時(shí)間越長顯微硬度越大。以上結(jié)果與AFM 再礦化后的粗糙度值分析結(jié)果一致，驗(yàn)證AFM量化測試的可行性。

表4 不同脫礦時(shí)間、再礦化時(shí)間下牙釉質(zhì)表面硬度值

表5 不同脫礦化時(shí)間下牙釉質(zhì)表面硬度比較

表6 不同再礦化時(shí)間下牙釉質(zhì)表面硬度比較

圖5 脫礦牙釉質(zhì)再礦化的硬度柱狀圖

2.4 AFM對牙釉質(zhì)脫礦及再礦化的細(xì)菌黏附力分析

變異鏈球菌和不同脫礦時(shí)間下牙釉質(zhì)表面黏附力曲線如圖6（a）所示。由曲線的后退部分（紅色）可以看出，變異鏈球菌和不同脫礦時(shí)間下牙釉質(zhì)黏附力具有明顯的差異。當(dāng)細(xì)菌修飾的探針慢慢接近被研究的牙釉質(zhì)，兩者之間距離為500 nm 左右時(shí)，探針受到指數(shù)增加的排斥力（紅色線），被迫離開牙釉質(zhì)表面。由于細(xì)菌與牙釉質(zhì)存在一定的黏附力，使得探針懸臂梁發(fā)生形變，再離開一定距離后，細(xì)菌和牙釉質(zhì)之間的結(jié)合斷裂，從而產(chǎn)生最大的黏附峰（黏附力）。由于不同脫礦時(shí)間的牙釉質(zhì)表面粗糙度存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此細(xì)菌和牙釉質(zhì)間的結(jié)合力也不一樣，探針懸臂梁產(chǎn)生的最大彈性形變也不相同。力曲線［見圖6（a）］和定量分析柱狀圖［見圖6（b）］表明，變異鏈球菌對不同脫礦時(shí)間的牙釉質(zhì)均存在表面黏附力，隨著粗糙度的增加黏附力增大，并存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這可能是由于：粗糙度越大，牙釉質(zhì)表面的黏附位點(diǎn)越多，為細(xì)菌黏附提供更多位點(diǎn)凹陷的表面結(jié)構(gòu)，也可為細(xì)菌提供更多的生存空間，更有利于細(xì)菌的黏附。當(dāng)脫礦牙釉質(zhì)經(jīng)過再礦化處理后，由于牙釉質(zhì)表面形成了一些羥基磷灰石晶體，使得表面粗糙度有所降低。同時(shí)，由定量分析柱狀圖（見圖7）可知，對相同再礦化時(shí)間的牙釉質(zhì)而言［見圖7（a）］，脫礦嚴(yán)重的牙釉質(zhì)的細(xì)菌黏附力依然較高，但均低于未再礦化處理組；對相同脫礦時(shí)間的牙釉質(zhì)而言［見圖7（b）］，隨著再礦化時(shí)間的增加，細(xì)菌黏附力降低，尤其是脫礦15 s 的牙釉質(zhì)經(jīng)過再礦化處理后，細(xì)菌黏附力降低更為顯著，但是均高于未脫礦的黏附力，表明粗糙度影響細(xì)菌對牙釉質(zhì)的黏附力，并且再礦化處理有助于降低細(xì)菌黏附力，從而有效降低患齲病的概率。

圖6 變異鏈球菌和不同脫礦時(shí)間下牙釉質(zhì)表面黏附力分析

圖7 變異鏈球菌和不同脫礦時(shí)間、再礦化時(shí)間下牙釉質(zhì)表面黏附力柱狀圖

3 結(jié) 語

AFM為牙釉質(zhì)脫礦及再礦化分析提供直觀成像和數(shù)據(jù)量化的技術(shù)支持。通過AFM 技術(shù)分析脫礦及再礦化處理的牙釉質(zhì)形貌、粗糙度變化，進(jìn)一步利用AFM技術(shù)研究口腔致齲菌變異鏈球菌對脫礦及再礦化牙釉質(zhì)的黏附力。結(jié)果表明，隨著酸蝕時(shí)間的增加，牙釉質(zhì)表面出現(xiàn)鱗狀顆粒，結(jié)構(gòu)疏松，粗糙度變大，細(xì)菌黏附力增加；經(jīng)過再礦化處理后，牙釉質(zhì)表面變得更為致密，粗糙度和黏附力均有所降低。同時(shí)，采用SEM和顯微硬度儀從形貌和硬度兩方面驗(yàn)證了AFM成像和量化數(shù)據(jù)的可靠性。