鐵皮石斛14-3-3 基因家族鑒定及表達(dá)分析

江林琪 趙佳瑩 鄭飛雄 姚馨怡 李效賢 俞振明，2

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，杭州 311402；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，杭州 310053）

隨著全球環(huán)境氣候的變化，植物因其固著生長(zhǎng)的屬性而無(wú)法規(guī)避所受到的環(huán)境脅迫，具有應(yīng)對(duì)低溫、干旱和鹽堿等非生物脅迫的特質(zhì)已逐漸成為影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵要素［1］。鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴滋補(bǔ)中藥材，被譽(yù)為“藥界大熊貓”。鐵皮石斛以莖入藥，可益胃生津，滋陰清熱；葉片可制作成食品，具有降脂的療效；花可制作成花草茶，具有降血糖及抗氧化的功效［2］。但由于鐵皮石斛對(duì)生存環(huán)境的需求較為嚴(yán)苛，極易受到干旱、鹽堿以及極端溫度等逆境脅迫的影響［3-4］，從而損害植物的生長(zhǎng)發(fā)育。

14?3?3 蛋 白，又 稱(chēng) 通 用 調(diào) 節(jié) 因 子（general regulatory factor, GRF），以多基因家族形式廣泛存在于真核生物中且高度保守［5］。14?3?3 蛋白最早發(fā)現(xiàn)于牛腦組織細(xì)胞中，因其在二乙氨乙基纖維素層析后的片段數(shù)量及在凝膠電泳中的遷移率而得名。植物14?3?3 蛋白依據(jù)序列同源性分為ε 類(lèi)（epsilon group）和非ε 類(lèi)（non?epsilon group），它們通過(guò)不同策略與靶蛋白相互作用，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、營(yíng)養(yǎng)代謝調(diào)控、逆境脅迫應(yīng)答等諸多調(diào)控過(guò)程［6-8］。

隨著基因組測(cè)序飛速發(fā)展，大量植物14?3?3 家族成員在基因組層面得以鑒定，例如辣椒（Capsicum annuum）［9］、馬鈴薯（Solanum tuberosum）［10］、黃瓜（Cucumis sativus）［11］、 水 稻（Oryza sativa）［12］、木 薯（Manihot esculenta）［13］、 茶 樹(shù)（Camellia sinensis）［14］等，表明植物14?3?3 蛋白在不同物種中廣泛存在，但這些基因在不同組織器官、外源激素及非生物脅迫下存在差異化的表達(dá)規(guī)律［15］，這與其氨基酸序列N 端和C 端的高度變異性息息相關(guān)。在水稻、大麥（Hordeum vulgare）、高粱（Sorghum bicolor）等禾本科植物中，GRF 家族成員響應(yīng)脫落 酸（abscisic acid, ABA）、 茉 莉 酸 甲 酯（methyl jasmonate, MeJA）、 赤 霉 素（gibberellin, GA）、 吲哚?3?乙酸（indole?3?acetic acid, IAA）等多種外源激素處理，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育及對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答過(guò)程［16］。擬南芥14?3?3λ 蛋白與蛋白激酶SOS2?like protein kinase 5 互作受鈣信號(hào)Ca2+激活調(diào)控并充當(dāng)分子開(kāi)關(guān)作用，進(jìn)而被鹽脅迫信號(hào)激活，協(xié)同介導(dǎo)質(zhì)膜H+?ATPase 活性來(lái)調(diào)控鈉離子Na+穩(wěn)態(tài)，提高擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受性［17］。在擬南芥中過(guò)量表達(dá)蘋(píng)果（Malus domestica）MdGRF13 基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因株系中過(guò)氧化酶（peroxidase, POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase, CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）的活性水平，降低葉片相對(duì)電導(dǎo)率及丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，最終增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的耐受能力［6］。然而截至目前對(duì)GRF 家族蛋白的研究主要聚焦于模式植物，鐵皮石斛14?3?3 基因家族及其成員的表達(dá)特征尚不清楚。

為研究GRF 蛋白在鐵皮石斛生長(zhǎng)發(fā)育及逆境應(yīng)答中的生物學(xué)功能，本研究基于鐵皮石斛染色體級(jí)別的基因組［4］，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)鐵皮石斛14?3?3 基因家族進(jìn)行全基因組鑒定，并對(duì)它們的理化性質(zhì)、保守基序、進(jìn)化關(guān)系、染色體定位，及在不同組織器官、低溫處理、鹽脅迫處理的表達(dá)水平進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究鐵皮石斛GRF 蛋白的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鐵皮石斛（D.officinale）采收自浙江中醫(yī)藥大學(xué)富春校區(qū)藥用植物園（E119.89, N30.08），于2022年6 月鐵皮石斛開(kāi)花期間采收根（根、根尖和氣生根）、莖、葉、花（花蕾、萼片、唇瓣、花粉、合蕊柱）等不同器官，用于分析DoGRF1-DoGRF17 基因在不同組織器官的表達(dá)水平。鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)條件與先前報(bào)道相一致［18］，6 月齡的組培苗轉(zhuǎn)接至250 mmol/L NaCl 的1/2 MS 培養(yǎng)基中，在25℃，16 h /8 h（光照/黑暗交替），光照強(qiáng)度為100 mmol/(m2·s)的人工氣候室中培養(yǎng)，分別在0、4、12 h 后收集鐵皮石斛的葉和根［19］，用于分析DoGRF1-DoGRF17 基因響應(yīng)鹽脅迫的表達(dá)水平。鐵皮石斛組培苗轉(zhuǎn)移至0℃培養(yǎng)箱，以人工氣候室中樣品為對(duì)照，6 h 后收集葉片，用于分析DoGRF1-DoGRF17 基因響應(yīng)低溫的表達(dá)水平。以上樣品經(jīng)液氮速凍后，均保存于?80℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛14?3?3 基因家族的挖掘與鑒定 在TAIR 網(wǎng)站（http://www.arabidopsis.org/）下載已公布的13 條擬南芥14?3?3 蛋白序列作為種子序列，在鐵皮石斛基因組［4］中通過(guò)BLAST 篩選（E?value ＜1e-5）并挖掘14?3?3 同源序列。通過(guò)NCBI?CDD 工具［20］對(duì)上述獲取的蛋白序列進(jìn)一步篩選并獲得候選14?3?3。同時(shí)，對(duì)候選序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域完整性的鑒定，在Pfam 網(wǎng)站（https://pfam.xfam.org）下載14?3?3 的保守結(jié)構(gòu)域（PF00244），利用HMMER軟件［21］，驗(yàn)證鐵皮石斛基因組中的14?3?3 候選成員。最終鑒定到17 條14?3?3 家族成員，據(jù)其在染色體上的位置命名為DoGRF1-DoGRF17。

1.2.2 鐵皮石斛14?3?3 家族成員理化性質(zhì)、染色體定位及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 利用ExPASy 網(wǎng)站（http://cn.expasy.org/tools）分析鐵皮石斛DoGRF1-DoGRF17的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)和總平均親水指數(shù)等理化性質(zhì)。通過(guò)BUSCA在 線(xiàn) 網(wǎng) 站（http://busca.biocomp.unibo.it/） 預(yù) 測(cè)DoGRF1-DoGRF17 蛋白的亞細(xì)胞定位。利用工具SOPMA（https://npsa?prabi.ibcp.fr/） 預(yù) 測(cè)DoGRF1-DoGRF17 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用鐵皮石斛基因組注釋文件獲取DoGRF1-DoGRF17 基因在染色體上的位置信息，通過(guò)TBtools 軟件［22］將DoGRF1-DoGRF17基因映射到染色體上，可視化基因的染色體定位。

1.2.3 鐵皮石斛14?3?3 家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 通過(guò)Phytozome 網(wǎng)站（http://www.phytozome.net）下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻、大豆（Glycine max）、非洲菊（Gerbera hybrida）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中已報(bào)道的14?3?3 蛋白序列，用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。將鐵皮石斛DoGRF1-DoGRF17 與上述5 種植物的14?3?3 蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，采用MEGA X 軟件［23］的NJ 法構(gòu)建鐵皮石斛DoGRF家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，Boostrap 值設(shè)置為1 000，其余默認(rèn)參數(shù)。

1.2.4 分析鐵皮石斛14?3?3 家族的保守基序及基因結(jié)構(gòu) 通過(guò)MEME 在線(xiàn)網(wǎng)站（https://meme?suite.org）分析鐵皮石斛DoGRF1-DoGRF17 序列的保守基序，將motif 查找數(shù)量定為10，通過(guò)TBtools 軟件將保守基序結(jié)果進(jìn)行可視化。

通過(guò)鐵皮石斛基因組的注釋文件獲取DoGRF1-DoGRF17 基因外顯子和內(nèi)含子的位置信息，利用GSDS 網(wǎng) 站（http://gsds.gao?lab.org/）繪 制DoGRF1-DoGRF17 基因的結(jié)構(gòu)特征。

1.2.5 分析鐵皮石斛14?3?3 家族基因啟動(dòng)子的順式作用元件 利用PlantCARE 網(wǎng)站（https://bioinformat?ics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）檢索鐵皮石斛DoGRF1-DoGRF17 基因啟動(dòng)子前2 000 bp 的順式作用元件，利用TBtools 軟件［22］對(duì)逆境響應(yīng)相關(guān)順式作用元件進(jìn)行可視化。

1.2.6 分析鐵皮石斛14?3?3 家族基因在不同組織器官的表達(dá)水平 為研究鐵皮石斛DoGRF 基因家族在不同組織器官的表達(dá)模式，從NCBI 下載鐵皮石斛莖、葉、花蕾、萼片、唇瓣、花粉、合蕊柱、根、根尖、氣生根的RNA?seq 數(shù)據(jù)［24］，通過(guò)HISAT、StringTie和Ballgown 軟件［25］組裝與評(píng)估轉(zhuǎn)錄本，并獲得鐵皮石斛在不同組織器官的表達(dá)量，最終利用TBtools軟件［22］可視化DoGRF1-DoGRF17 基因的表達(dá)水平。

1.2.7 分析鐵皮石斛14?3?3 家族基因在低溫及鹽脅迫處理下的表達(dá)水平 采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（0416?50, 北京華越洋生物科技有限公司）參照說(shuō)明書(shū)分別提取受低溫處理的鐵皮石斛葉，及鹽脅迫處理的根和葉總RNA［26］，通過(guò)NanoDrop2000 分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific,美國(guó)馬薩諸塞州）檢測(cè)所得總RNA 的濃度和質(zhì)量。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit（RR047A, TaKaRa,中國(guó)大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所得的cDNA 分析DoGRF1-DoGRF17 基因在低溫及鹽脅迫處理下的表達(dá)水平。

選 擇 鐵 皮 石 斛EF?1α 為 內(nèi) 參 基 因［27］，利 用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)DoGRF1-DoGRF17 基因的熒光定量PCR 引物（表1）。將低溫及鹽脅迫處理下鐵皮石斛根或葉的cDNA 質(zhì)量濃度定量為50 ng/μL，按照iTaqTMuniversal SYBR?Green（1725121, Bio?Rad Laboratories, 美國(guó)加利福尼亞州）操作說(shuō)明在ABI 7500 熒光定量PCR 儀（Applied Biosystems, 美國(guó)加利福尼亞州）上進(jìn)行定量PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系（10 μL）為iTaqTMuniversal SYBR?Green supermix 5 μL，上、下游引物（10 mmol/L）各0.5 μL，cDNA 模板1 μL,ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s，及40 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（95℃變性10 s，60℃退火30 s）。每個(gè)處理的樣品含3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。利用2-ΔΔCt法［28］計(jì)算鐵皮石斛DoGRF1-DoGRF17 在低溫及鹽脅迫處理下的相對(duì)表達(dá)量，通過(guò)Student’s t?test 比較處理組與對(duì)照組間的顯著性。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

2 結(jié)果

2.1 鐵皮石斛14?3?3家族基因的鑒定及理化分析

通過(guò)生物信息學(xué)方法，在鐵皮石斛基因組中共鑒定到17 個(gè)14?3?3 家族成員，根據(jù)這些基因所在的亞家族及染色體上的位置命名為DoGRF1-DoGRF17（表2）。ExPASy 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，17 個(gè)鐵皮石斛DoGRF 成員的氨基酸數(shù)介于144-299 aa，最大的為DoGRF2；分子量為16.29-34.17 kD，平均分子量為28.77 kD；等電點(diǎn)介于4.73-9.03 之間，平均值為5.84；不穩(wěn)定系數(shù)介于39.17-51.58，脂肪系數(shù)介于91.80?103.33；DoGRF1-DoGRF17蛋白均具有較強(qiáng)的親水性，以DoGRF16 蛋白的親水性最強(qiáng)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，DoGRF13 和DoGRF17 定位于葉綠體，其余15個(gè)DoGRF 成員均定位在細(xì)胞核上。

表2 鐵皮石斛DoGRF 蛋白的理化性質(zhì)分析Table 2 Physicochemical properties of DoGRF proteins in D.officinale

2.2 鐵皮石斛14?3?3家族基因的染色體定位分析

根據(jù)鐵皮石斛全基因組注釋結(jié)果，繪制了DoGRF 家族成員的染色體定位圖譜（圖1?A）。結(jié)果顯示，除DoGRF17 未錨定到特定的染色體外，其余16 個(gè)DoGRF 成員不均勻地分布在Chr1、Chr5、Chr7、Chr10、Chr12、Chr16 和Chr17 這7 條染色體上，Chr12 染色體上有3 個(gè)（DoGRF9、DoGRF10、DoGRF11），Chr16 染色體上也有3 個(gè)（DoGRF12、DoGRF13、DoGRF14），Chr1、Chr5、Chr7、Chr10和Chr17 染色體上分別存在2 個(gè)不同的成員。

圖1 鐵皮石斛DoGRF 家族成員的染色體定位（A）及復(fù)制事件分析（B）Fig.1 Chromosomal localization（A）and replication events（B）of the DoGRF family members in D.officinale

進(jìn)一步研究了DoGRF 家族基因間的共線(xiàn)性關(guān)系（圖1?B），結(jié)果顯示，7 對(duì)DoGRF 基因有共線(xiàn)性關(guān)系，DoGRF1 和DoGRF5、DoGRF2 和DoGRF6、DoGRF2 和DoGRF8、DoGRF3 和DoGRF16、DoGRF4和DoGRF12、DoGRF6 和DoGRF7、DoGRF13 和DoGRF15 互為串聯(lián)復(fù)制基因?qū)Γf(shuō)明DoGRF 家族成員在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了染色體片段復(fù)制事件。

2.3 鐵皮石斛14?3?3家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

通過(guò)DNAMAN 軟件對(duì)17 個(gè)鐵皮石斛14?3?3 家族蛋白進(jìn)行多重序列比對(duì)（圖2），結(jié)果顯示，它們具 有 保 守 的14?3?3 結(jié) 構(gòu) 域（LGLALNFSVFYYEI），序列一致性達(dá)到55.05%，中間區(qū)域的序列相似度較高，尤其是紅色框內(nèi)的序列，它們均是14?3?3 蛋白的保守核心區(qū)。N 端和C 端的序列變異程度較大，這可能是造成DoGRF 成員存在功能差異的原因。

圖2 鐵皮石斛DoGRF 家族蛋白的多重序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of the DoGRF family proteins in D.officinale

為了分析GRF 蛋白間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)MEGA 軟件繪制了鐵皮石斛、水稻、擬南芥、大豆、蒺藜苜蓿、非洲菊中的73 條GRF 蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3），結(jié)果顯示，所有14?3?3 蛋白主要分為ε-type group 和non ε-type group 兩大分支，8個(gè) 成 員（DoGRF1、DoGRF5、DoGRF6、DoGRF8、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17） 隸屬ε-type group， 其 余 的9 個(gè) 成 員（DoGRF2、DoGRF3、DoGRF4、DoGRF7、DoGRF9、DoGRF10、DoGRF11、DoGRF12、DoGRF13） 隸 屬non ε-type group。鐵皮石斛DoGRF 蛋白與單子葉植物水稻GRF 蛋白的親緣關(guān)系相對(duì)較近，與雙子葉植物擬南芥、大豆、蒺藜苜蓿、非洲菊中GRF 蛋白的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，推測(cè)可能是植物14?3?3 蛋白在單子葉植物與雙子葉植物是平行進(jìn)化的兩支，形成了相對(duì)獨(dú)立的類(lèi)群。

圖3 鐵皮石斛、水稻、擬南芥、大豆、蒺藜苜蓿、非洲菊GRF 家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of GRF family members in D.officinale, O.sativa, A.thaliana, G.max, M.truncatula and G.hybrida

2.4 鐵皮石斛14?3?3家族成員的保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

基于鐵皮石斛全基因組的注釋文件，繪制了DoGRF 家族成員的基因結(jié)構(gòu)（圖4?A），結(jié)果顯 示，6 個(gè) 成 員（DoGRF4、DoGRF5、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17）不 含 非 編 碼 區(qū)（untranslated regions, UTR），其余成員均含有3'?UTR和5'?UTR。所有DoGRF 家族成員含2-7 個(gè)編碼區(qū)（coding region, CDS），DoGRF10 長(zhǎng)度達(dá)到71 550 bp，含有5 個(gè)CDS 和2 個(gè)UTR，而DoGRF14 長(zhǎng)度僅為972 bp，含有2 個(gè)CDS。

圖4 鐵皮石斛DoGRF 家族成員的基因結(jié)構(gòu)（A）、保守基序（B）及基序標(biāo)識(shí)（C）Fig.4 Gene structure（A）, conserved motifs（B）, and motif logo（C）of DoGRF family members in D.officinale

鐵皮石斛DoGRF 家族成員中鑒定到8 個(gè)保守基序（圖4?B-C），結(jié)果顯示，所有成員均存在motif 2（含KMKGDY 序列）和6，非ε 類(lèi)DoGRF 成員含有7 個(gè)保守基序，ε 類(lèi)DoGRF 成員含有2-7 個(gè)保守基序，聚類(lèi)在同一分支上的DoGRF 成員具有類(lèi)似的保守基序，motif 8 僅分布在DoGRF15、DoGRF16 和DoGRF17 中。

2.5 鐵皮石斛14?3?3家族成員的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)SOMPA 軟件分析了DoGRF 家族蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)（表3），結(jié)果顯示，DoGRF 家族成員均有α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和隨機(jī)卷曲4 種二級(jí)結(jié)構(gòu)類(lèi)型，所占比例大小依次為α-螺旋（平均51.02%）、隨機(jī)卷曲（平均31.05%）、延伸鏈（平均12.63%）和β-折疊（平均5.29%）。DoGRF6 的α-螺旋占比（67.43%）最大，DoGRF13 的延伸鏈占比（16.28%）最大，DoGRF14 的隨機(jī)卷曲（38.46%）和β-折疊（10.65%）占比最大。

表3 鐵皮石斛DoGRF 成員的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析Table 3 Analysis of secondary structure of DoGRF proteins in D.officinale

2.6 鐵皮石斛14?3?3家族基因的啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用PlantCARE 網(wǎng)站分析了鐵皮石斛DoGRF 家族基因啟動(dòng)子上的順式作用元件及其響應(yīng)激素和非生物脅迫的功能，獲得9 個(gè)順式作用元件（水楊酸響應(yīng)、光照響應(yīng)、生長(zhǎng)素響應(yīng)、低溫響應(yīng)、茉莉酸響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)、干旱誘導(dǎo)、脫落酸響應(yīng)、防御與脅迫）并將其可視化（圖5）。結(jié)果顯示，DoGRF1和DoGRF17 啟動(dòng)子上存在上述9 種順式作用元件，而DoGRF14 啟動(dòng)子上僅含1 種順式作用元件（光照響應(yīng)）。94.1%的DoGRF 成員的啟動(dòng)子上含有光照響應(yīng)元件（DoGRF4 除外），76.5%的DoGRF 成員的啟動(dòng)子上含有茉莉酸響應(yīng)元件（DoGRF4、DoGRF6、DoGRF10、DoGRF14 除外）。此外，還有10 個(gè)、9個(gè)、11 個(gè)DoGRF 成員的啟動(dòng)子上分別含有低溫響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)和水楊酸響應(yīng)元件，暗示大多數(shù)DoGRF家族成員能夠響應(yīng)植物激素的處理，并受環(huán)境脅迫應(yīng)答的誘導(dǎo)。

圖5 鐵皮石斛DoGRF 家族基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析Fig.5 Analysis of cis-regulatory elements on the promoters of DoGRF family genes in D.officinale

2.7 鐵皮石斛14?3?3家族基因的組織表達(dá)特性分析

為了明晰鐵皮石斛DoGRF 成員在不同組織中的表達(dá)特征，通過(guò)已公布轉(zhuǎn)錄組［22］分析了17 個(gè)DoGRF 家族基因在鐵皮石斛花蕾（flower bud）、萼片（sepal）、 唇 瓣（labellum）、 花 粉（pollinium）、合 蕊 柱（gynostemium）、 莖（stem）、 葉（leaf）、根（root）、綠色根尖（green root tip）、白色氣生根（white part root）中的表達(dá)量，結(jié)果（圖6）顯示，DoGRF 家族成員在所有組織中均有表達(dá)，但具有組織表達(dá)特異性且成員間的表達(dá)水平存在差異，有5個(gè) 基 因（DoGRF6、DoGRF7、DoGRF8、DoGRF9、DoGRF11）在莖中的表達(dá)量最高，有2 個(gè)基因（DoGRF2、DoGRF5）在根中的表達(dá)量最高，其余10 個(gè)DoGRF 基 因（DoGRF1、DoGRF3、DoGRF4、DoGRF10、DoGRF12、DoGRF13、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17）均在花粉中的表達(dá)量最高，暗示它們?cè)诨ㄆ鞴侔l(fā)育中可能起重要的作用。

圖6 鐵皮石斛DoGRF 家族基因的組織特異性表達(dá)分析Fig.6 Tissue specific expression analysis of DoGRF family genes in D.officinale

2.8 鐵皮石斛14?3?3家族基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式分析

基于大多數(shù)DoGRF 家族成員的啟動(dòng)子上含有逆境響應(yīng)元件（圖5），分析了DoGRF 家族基因在非生物脅迫（低溫和鹽脅迫）下的表達(dá)水平，結(jié)果（圖7）顯示，共有10 個(gè)基因（DoGRF1、DoGRF3、DoGRF5、DoGRF6、DoGRF8、DoGRF9、DoGRF12、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17）在鐵皮石斛葉低溫處理后呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)；其余7 個(gè)基因（DoGRF2、DoGRF4、DoGRF7、DoGRF10、DoGRF11、DoGRF13、DoGRF14）在鐵皮石斛葉低溫處理后呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。

圖7 鐵皮石斛DoGRF 家族基因在低溫處理下的表達(dá)水平Fig.7 Expressions of DoGRF family genes under low-temperature stress in D.officinale

此外，分析了鐵皮石斛葉片和根中DoGRF 家族基因響應(yīng)鹽脅迫處理的表達(dá)水平，結(jié)果（圖8）顯示，鹽脅迫處理下，DoGRF12、DoGRF15、DoGRF17在葉片中的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異，DoGRF5、DoGRF6、DoGRF9 在根系中的表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異。在葉片中，共有4 類(lèi)基因表達(dá)的模式：7 個(gè)基因（DoGRF1、DoGRF2、DoGRF5、DoGRF8、DoGRF9、DoGRF10、DoGRF16）呈現(xiàn)不斷上調(diào)表達(dá)；2 個(gè)基因（DoGRF6、DoGRF14）呈現(xiàn)不斷下調(diào)表達(dá)；3 個(gè)基因（DoGRF7、DoGRF11、DoGRF13）呈現(xiàn)先減少后增加的表達(dá)趨勢(shì)；2 個(gè)基因（DoGRF3、DoGRF4）呈現(xiàn)先增加后減少的表達(dá)趨勢(shì)。在根中，鹽脅迫處 理 后6 個(gè) 基 因（DoGRF1、DoGRF7、DoGRF8、DoGRF10、DoGRF11、DoGRF12）的表達(dá)量明顯降低，8 個(gè)基因（DoGRF2、DoGRF3、DoGRF4、DoGRF13、DoGRF14、DoGRF15、DoGRF16、DoGRF17） 的 表達(dá)量明顯增加。

3 討論

鐵皮石斛染色體級(jí)別基因組的發(fā)布為抗逆基因挖掘及其進(jìn)化提供了重要的遺傳信息［4］。真核生物中高度保守的14?3?3（GRF）家族蛋白通過(guò)磷酸化修飾調(diào)控靶蛋白活性，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝產(chǎn)物合成和環(huán)境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用［5］。本研究共在鐵皮石斛基因組中鑒定到17 個(gè)DoGRF 家族成員，比擬南芥（13 個(gè)）［9］、水稻（8 個(gè)）［12］、辣椒（15個(gè)）［9］、番茄（Solanum lycopersicum; 12 個(gè)）［29］、二穗短柄草（Brachypodium distachyon; 12 個(gè)）［15］中的數(shù)量多，比大豆（18 個(gè)）［11］、蘋(píng)果（18 個(gè)）［30］中的數(shù)量少，表明鐵皮石斛中的14?3?3 家族有所擴(kuò)張，這可能與鐵皮石斛普遍適應(yīng)低溫、干旱、強(qiáng)光照等逆境的需求相關(guān)。此外，DoGRF17 未錨定到染色體上，其余16 個(gè)DoGRF 成員不均勻定位在7 條染色體上，每條染色體上含有2-3 個(gè)成員，并且存在7對(duì)串聯(lián)復(fù)制基因具有同源進(jìn)化關(guān)系，包括串聯(lián)和節(jié)段復(fù)制，表明鐵皮石斛DoGRF 基因家族的擴(kuò)增可能是由基因復(fù)制事件造成的［14］。

鐵皮石斛17 個(gè)DoGRF 成員均具有14?3?3 家族的保守功能域（PF00244），氨基酸平均數(shù)為256，分子量平均數(shù)為28.77 kD，pI 平均值為5.84，這與其他物種中GRF 蛋白分子量約30 kD，且為酸性蛋白質(zhì)氨基酸（pI ＜ 7.0）相一致［11-13］，表明GRF 家族蛋白在植物中相對(duì)保守。DoGRF 家族蛋白均是親水蛋白，暗示它們?cè)陧憫?yīng)環(huán)境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用，二級(jí)結(jié)構(gòu)以具有剛性的α-螺旋為主（平均占比51.02%），為蛋白質(zhì)的構(gòu)象提供支撐力［7］。

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析，DoGRF 家族成員分為ε-type和non ε-type 兩大亞族，與單子葉水稻親緣關(guān)系相對(duì)較近，與雙子葉擬南芥、大豆親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與早期植物GRF 蛋白進(jìn)化為兩支的觀點(diǎn)相一致［8］。單子葉與雙子葉植物中的GRF 成員在進(jìn)化上相對(duì)獨(dú)立且保守，具有不同的路徑和進(jìn)化趨勢(shì)，進(jìn)而呈現(xiàn)2 個(gè)相對(duì)獨(dú)立的平行進(jìn)化類(lèi)群［13］。GRF 家族蛋白序列中間的motif 2 和motif 6 在DoGRF 家族中高度保守，N 端和C 端的變異性較大，C?端α7-α9 螺旋上的疏水殘基通過(guò)非磷酸化識(shí)別序列與靶蛋白直接互作。N?端12-30 氨基酸殘基對(duì)蛋白二聚體形成及配體偶聯(lián)起著關(guān)鍵的作用，進(jìn)而影響與受體膜的識(shí)別，是導(dǎo)致GRF 蛋白功能多樣性和復(fù)雜性的基礎(chǔ)［5-7］。

鐵皮石斛DoGRF 家族基因的表達(dá)具有組織特異性，在鐵皮石斛花蕾、萼片、唇瓣、花粉、合蕊柱、莖、葉、根、綠色根尖、白色氣生根中呈現(xiàn)差異性的表達(dá)，10 個(gè)基因在花中表達(dá)最高，其次是莖（5 個(gè)）和根（2個(gè)），推測(cè)DoGRF 基因在調(diào)控不同組織的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)生了功能的分化。

啟動(dòng)子區(qū)域存在大量的順式作用元件，對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)具有顯著影響。多種非生物（高鹽、低溫、干旱）逆境能誘導(dǎo)14?3?3 基因的表達(dá)，其啟動(dòng)子上游的順式元件對(duì)其表達(dá)量起著至關(guān)重要影響［15-16］。鐵皮石斛DoGRF 家族基因啟動(dòng)子區(qū)域富集了大量脫落酸、茉莉酸等激素響應(yīng)元件，及低溫、干旱誘導(dǎo)等逆境響應(yīng)元件。各個(gè)成員包含的元件數(shù)量與種類(lèi)也存在差異，推測(cè)鐵皮石斛DoGRF 家族基因的表達(dá)可能與激素誘導(dǎo)及抗逆應(yīng)答有關(guān)，與辣椒［9］、茶樹(shù)［14］、蘋(píng)果［30］等GRF 蛋白響應(yīng)非生物脅迫相一致。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多類(lèi)非生物脅迫（如低溫、鹽脅迫）可誘導(dǎo)不同DoGRF 基因的表達(dá)，低溫處理促進(jìn)7 個(gè)DoGRF 基因顯著上調(diào)表達(dá)，鹽脅迫處理促進(jìn)葉中7 個(gè)DoGRF 基因顯著上調(diào)表達(dá)，根中8 個(gè)DoGRF 基因顯著上調(diào)表達(dá)。GRF 蛋白響應(yīng)低溫應(yīng)答的研究主要聚焦在擬南芥中，受體激酶CRPK1 負(fù)調(diào)控植物的低溫耐受性，可被低溫激活并磷酸化14?3?3λ 蛋白，促使14?3?3λ 蛋白由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，與CBF3 蛋白互作致其泛素化降解，進(jìn)而不利于植物耐受低溫脅迫［31］。在鹽脅迫誘導(dǎo)下，水稻幼苗及愈傷組織中GRF 蛋白的表達(dá)水平明顯增加［12］。過(guò)表達(dá)OsGF14b 基因促進(jìn)水稻耐鹽性顯著增加，敲除該基因使其對(duì)鹽脅迫相當(dāng)敏感，并且鹽脅迫有利于OsGF14b 與OsPLC1 互作，抑制OsPLC1 的泛素化降解，促進(jìn)三磷酸肌醇和二酰甘油的生成，激活胞內(nèi)Ca2+信號(hào)從而提高水稻的耐鹽性［32］。有趣的是，鐵皮石斛DoGRF2 基因同時(shí)被低溫和鹽脅迫處理誘導(dǎo)表達(dá)，這與該基因的啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到的低溫響應(yīng)、防御與脅迫元件相吻合［7-8］，具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究在鐵皮石斛中共鑒定出17 個(gè)14?3?3（GRF）家族基因，編碼144-299 個(gè)氨基酸，分為ε類(lèi)和非ε 類(lèi)，分布在7 條染色體上，含高度保守的motif 2 和motif 6，N 端和C 端變異性較大。該家族基因啟動(dòng)子上富集大量的激素和逆境應(yīng)答相關(guān)的順式元件。DoGRF 家族基因在各個(gè)組織均有表達(dá)，具有組織特異性，并在低溫及鹽脅迫下存在差異表達(dá)，暗示它們廣泛參與非生物脅迫。