大麻二酚對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦皮質(zhì)Occludin、ZO-1表達(dá)水平及血腦屏障通透性的影響

李佳麗,曹 艷,凌騰晗,尹愛平,李恒希,李經(jīng)輝,張瑞林,吳海鷹,李 坪

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是一種由于外力作用于大腦而導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1-2]。TBI的繼發(fā)性損傷涉及血腦屏障(blood brain barrier,BBB)受損、水腫、炎癥等復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng),BBB主要由緊密連接的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞足板和基底膜組成,在維持大腦穩(wěn)態(tài)中至關(guān)重要。其完整性與緊密連接蛋白密切相關(guān),主要包括閉合蛋白(Occludin)、密封蛋白和閉鎖小帶蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1),緊密連接蛋白Occludin和ZO-1被認(rèn)為是判斷BBB完整性的標(biāo)志物[3]。BBB受損被認(rèn)為是TBI高發(fā)病率和高病死率的主要危險(xiǎn)因素之一[4-5],因此尋找藥物干預(yù)TBI后BBB損傷具有重要意義。大麻二酚(cannabidiol,CBD)是天然植物大麻的主要提取物之一,具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖以及抑制凋亡等神經(jīng)保護(hù)作用,能夠改善腦損傷[6-7]。但其是否對緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達(dá)水平產(chǎn)生干預(yù)作用以及干預(yù)作用是否隨著干預(yù)時(shí)間變化而產(chǎn)生變化尚不明確。因此,該研究旨在探討CBD對TBI后緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達(dá)水平和對BBB滲透性的干預(yù)作用,從而探索TBI潛在治療藥物,以及為CBD用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級SD雄性大鼠,體質(zhì)量260～280 g,共72只,由實(shí)驗(yàn)動物中心提供。提前1周運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室,常規(guī)飼養(yǎng)(溫度20～25 ℃、濕度55%～65%,給予自由飲食、飲水)。

1.1.2主要試劑和儀器 CBD粉末(云南漢素公司,貨號:20200601,純度≥99.5%)兔抗大鼠ZO-1多克隆抗體(江蘇親科生物研究中心有限公司,貨號:AF5145),兔抗大鼠Occludin多克隆抗體(貨號:27260-1-AP),兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(貨號:20536-1-AP),HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(貨號:SA00001-2)均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(貨號:C2306),含DAPI的抗熒光衰減封片劑(貨號:F6057)均購自美國sigma公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號:P00010),即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,貨號:KIT-9720),高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(北京蘭杰柯科技有限公司,貨號:BL520A),三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司,貨號:R050965),氫氧化鈉(sodium hydroxide,NaOH,云南景銳科技有限公司,貨號:K7-1),多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司,型號:Multiskan FC),大鼠腦立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司,型號:68802),VICTOR NivoTM多模式微孔板檢測儀(美國Perkin Elmer公司,型號:VICTOR NivoTM),光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司,型號:DM4000B),凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司,型號:Chemi DocTMXRS+),熒光倒置顯微鏡(德國Zeiss公司,型號:Axio Observer)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及模型制備 SD大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(Sham組)、模型組(TBI+vehicle組)和CBD干預(yù)組(TBI+CBD組),每組24只大鼠。每個(gè)組又分為損傷后8 h、1、2、3、5和7 d共 6個(gè)時(shí)間點(diǎn),觀察TBI急性期損傷情況。模型組和CBD干預(yù)組大鼠的TBI模型采用改良“Feeney自由落體撞擊法”制備。大鼠采用2%戊巴比妥鈉(2 ml/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉,后固定于腦立體定位儀上,頭頂部消毒后,以矢狀縫右側(cè)2.5 mm和冠狀縫下側(cè)2 mm為中心,開一個(gè)直徑約6 mm的骨窗。將40 g砝碼通過銅管從15 cm高度落下,打擊撞擊子至腦組織從而造成TBI。止血后用骨蠟封閉骨窗并縫合皮膚。假手術(shù)組不進(jìn)行打擊,其余步驟相同。CBD粉末先溶于DMSO,再使用2% Tween-80生理鹽水稀釋至終濃度為1%。在TBI大鼠造模前30 min、TBI造模后6 h以及之后每 d直至取材前1 d對CBD干預(yù)組大鼠進(jìn)行CBD(10 mg/kg)[8]腹腔注射。模型組注射等體積溶劑(2% Tween-80生理鹽水)。根據(jù)免疫組化檢測Occludin和ZO-1蛋白陽性表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以及課題組前期探索出腦損傷高峰期為2 d,后續(xù)模型組使用造模后2 d(TBI 2d+vehicle組)大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色檢測腦組織Occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá) 3組大鼠,在6個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)處死,提取腦組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋,制備厚度為5 μm的冠狀石蠟切片。利用即用型免疫組化超敏UltraSensitiveTMSP試劑盒進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。切片常規(guī)脫蠟至水后,進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù),冷卻至室溫,滴加試劑1(內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑)室溫孵育10 min,試劑2(非特異性染色阻斷劑)室溫孵育20 min,滴加兔抗大鼠ZO-1多克隆抗體或兔抗大鼠Occludin多克隆抗體(1∶500)于4 ℃冰箱過夜,次日室溫接著孵育30 min至室溫,滴加試劑3(生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG聚合物)室溫孵育1 h,滴加試劑4(鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶)室溫孵育15 min,DAB顯色,梯度乙醇脫水、二甲苯透明后使用中性樹膠封固切片。采圖部位位于打擊損傷處靠近中縫的位置,采集大腦損傷側(cè)皮質(zhì)區(qū)染色結(jié)果圖,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,使用ImageJ軟件分析免疫陽性細(xì)胞的平均光密度值。

1.2.3免疫熒光染色檢測腦組織Occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)情況 石蠟切片抗原修復(fù)后,使用10%山羊血清室溫封閉1 h,滴加兔抗大鼠ZO-1多克隆抗體或兔抗大鼠Occludin多克隆抗體(1∶200)于4 ℃冰箱過夜,次日室溫復(fù)溫30 min后,滴加Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(1∶200)室溫孵育1 h,使用含有DAPI的抗熒光衰減封片劑封片。采圖部位位于打擊損傷處靠近中縫的位置,采集大腦損傷側(cè)皮質(zhì)區(qū)染色結(jié)果圖,每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,使用ImageJ軟件分析陽性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn)檢測腦組織Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)量 提取各組大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)區(qū)腦組織蛋白,通過BCA法測定蛋白濃度。每孔取20 μg樣品蛋白,通過SDS-PAGE凝膠電泳將蛋白分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,室溫下用5%脫脂牛奶封閉2 h后,用1∶1 000的兔抗大鼠Occludin或ZO-1多克隆抗體和1∶5 000的兔抗大鼠β-actin多克隆抗體4 ℃搖床孵育過夜,次日用1∶10 000的HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗室溫孵育1 h。采用高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒和ChemiDocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)顯色并進(jìn)行采圖,使用ImageJ軟件分析灰度值。

1.2.5熒光素鈉法檢測大鼠BBB通透性 建立熒光素鈉溶液濃度為0～0.05 μg/ml的熒光強(qiáng)度值標(biāo)準(zhǔn)曲線,R2=0.997。3組大鼠2 d后以2 ml/kg的劑量腹腔注射熒光素鈉溶液(100 mg/ml,溶解于PBS中),循環(huán)30 min后麻醉大鼠進(jìn)行造模,心臟灌注取損傷側(cè)腦皮質(zhì)組織100 mg,加入500 μl的7.5%TCA研磨成勻漿,再加入500 μl的PBS沖洗混勻,4 ℃、10 000 r/min離心10 min,收集上清液。黑色96孔板中每孔加入120 μl上清液和30 μl的5 mol/L NaOH,用多功能酶標(biāo)儀在excitation 波長485 nm和emission 波長530 nm處測定樣本熒光強(qiáng)度值,帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線算出熒光素鈉濃度。

2 結(jié)果

2.1 CBD干預(yù)后上調(diào)TBI大腦損傷側(cè)皮質(zhì)區(qū)Occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)3組大鼠免疫組化結(jié)果顯示,Occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)呈點(diǎn)狀及不規(guī)則形狀(圖1A、B)。對Occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,隨著時(shí)間推移,不同時(shí)間點(diǎn)的TBI+vehicle組Occludin、ZO-1蛋白陽性表達(dá)均下降,其中2 d下降最明顯(tOccludin=3.570、4.053、7.479、5.290、4.590、3.622,均P<0.05;tZO-1=2.823、4.112、4.681、3.925、4.924、3.667,均P<0.05);與TBI+vehicle組相比,TBI+CBD組Occludin、ZO-1平均光密度值在1 d后均升高(tOccludin=4.444、7.699、3.432、4.916、4.194,均P<0.05;tZO-1=0.142、2.858、3.251、3.697、2.970、3.406,均P<0.05)。見圖1C、D。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測各組大鼠緊密連接蛋白Occludin、ZO-1陽性表達(dá)

2.2 CBD干預(yù)TBI大腦損傷側(cè)皮質(zhì)區(qū)Occludin、ZO-1平均熒光強(qiáng)度值升高3組大鼠免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Occludin、ZO-1陽性表達(dá)成點(diǎn)狀、條索狀或不規(guī)則狀(圖2A、B)。對二者陽性表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,TBI 2 d+vehicle組Occludin、ZO-1平均熒光強(qiáng)度值下降(t=2.593、3.735,均P<0.05);與TBI 2 d+vehicle組相比,CBD干預(yù)后平均熒光強(qiáng)度值均升高(t=3.227、3.523,均P<0.05)。見圖2C、D。

圖2 免疫熒光染色檢測各組大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)區(qū)Occludin、ZO-1平均熒光強(qiáng)度表達(dá)情況

2.3 CBD干預(yù)TBI大腦損傷側(cè)皮質(zhì)區(qū)Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)量升高Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Sham組相比,TBI 2 d+vehicle組Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)量下降(t=4.861、6.048,均P<0.01);與TBI 2 d+vehicle組相比,CBD干預(yù)后Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)量均升高(t=6.067、4.320,均P<0.05),見圖3。

圖3 Western blot檢測各組大鼠損傷側(cè)皮質(zhì)區(qū)Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)量

2.4 CBD干預(yù)TBI大鼠BBB滲透性降低熒光素鈉實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Sham組相比,TBI 2 d后,大鼠腦皮質(zhì)組織的熒光素鈉含量上升(t=5.156,P<0.01),提示BBB滲透性升高;與TBI 2 d+vehicle組相比,CBD干預(yù)后大鼠腦皮質(zhì)組織的熒光素鈉含量明顯下降(t=2.785,P<0.05),提示BBB滲透性下降。見圖4。

圖4 大鼠腦皮質(zhì)組織熒光素鈉熒光強(qiáng)度的比較

3 討論

TBI在全國乃至全球的致殘率、致死率仍居高不下,TBI后BBB的破壞是繼發(fā)性腦損傷的風(fēng)險(xiǎn)之一。BBB作為維持大腦穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),其完整性具有重要意義。當(dāng)BBB結(jié)構(gòu)遭到破壞,其滲透性發(fā)生變化,從而導(dǎo)致大腦內(nèi)環(huán)境遭到破壞。本研究結(jié)果顯示,TBI后大鼠Occludin和ZO-1均下降,這與Yan et al[9]人研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究顯示Occludin和ZO-1在TBI后2 d表達(dá)量最低,證明了緊密連接蛋白Occludin和ZO-1參與了TBI后病理改變,TBI后大鼠BBB遭到破壞。這與Fu et al[10]人研究結(jié)果近似。另外有研究[11]顯示,大鼠低壓缺氧后7 d腦組織熒光素鈉含量明顯升高,說明BBB完整性受損,通透性升高,這與本研究結(jié)果近似。本研究結(jié)果顯示TBI后2 d腦組織熒光素鈉含量升高,BBB滲透性升高,CBD干預(yù)后腦組織熒光素鈉含量下降,BBB滲透性下降。

CBD是天然植物大麻的主要提取物之一,因其不具有精神活性且易穿過BBB,在多種中樞系統(tǒng)神經(jīng)疾病中均發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值[6-7]。Belardo et al[12]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),口服CBD可減輕TBI小鼠的神經(jīng)功能障礙。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CBD干預(yù)后1、2、3、5和7 d,緊密連接蛋白Occludin和ZO-1陽性表達(dá)升高。CBD干預(yù)2 d后Occludin和ZO-1的平均熒光強(qiáng)度以及蛋白表達(dá)量都出現(xiàn)升高,同時(shí)BBB滲透性下降,以上均提示CBD對TBI后BBB的破壞具有一定的保護(hù)作用,降低了BBB滲透性,保護(hù)了BBB完整性。

綜上所述,本研究顯示TBI后緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達(dá)下降,BBB滲透性升高,CBD干預(yù)可逆轉(zhuǎn)TBI對BBB的破壞。本研究為治療TBI提供潛在有效藥物,然而關(guān)于CBD干預(yù)BBB滲透性的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。