斑點(diǎn)叉尾鮰ZBTB38的原核表達(dá)、多克隆抗體制備及應(yīng)用

張世勇 劉洪巖 鐘立強(qiáng) 趙彥華 王明華 陳校輝 ，

（1江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；2江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014）

ZBTB38（又被稱為CIBZ、ZNF921或PPP1R171）屬于ZBTB蛋白家族（zinc finger and BTB domain-containing protein family），是分子量最大、結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的蛋白之一，其N端具有1個(gè)BTB結(jié)構(gòu)域（Broad-Complex，Tramtrack and Bric a brac domain）（約115 個(gè)氨基酸），C 端一般具有5～10 個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc finger domain）。該蛋白家族C 端的鋅指結(jié)構(gòu)分為兩種類型，即C2H2 型和C2HC型，識(shí)別固定的順式作用元件或與DNA 甲基化位點(diǎn)結(jié)合［1］，N 端的BTB 結(jié)構(gòu)域一般介導(dǎo)同源或異源蛋白形成二聚體或多聚體，改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，從而起到調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的目的［2］。ZBTB 蛋白家族中部分成員已證實(shí)在精子發(fā)生［3］、性別決定［4］、神經(jīng)和器官發(fā)育［5］、腫瘤發(fā)生［6］等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。

斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictaluruspunctatus）是我國(guó)特色淡水魚類的重要組成部分。自1984 年從美國(guó)引入我國(guó)后，先后突破苗種繁育、養(yǎng)殖技術(shù)、質(zhì)量安全控制與產(chǎn)品加工等技術(shù)難關(guān)，形成了完整的產(chǎn)業(yè)鏈條，備受烤魚市場(chǎng)和預(yù)制菜行業(yè)的青睞。自“十三五”以來，斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)業(yè)的發(fā)展持續(xù)向好，是我國(guó)目前最為熱門的淡水魚養(yǎng)殖品種之一，隨著其養(yǎng)殖面積和總產(chǎn)量不斷增加，2022 年全國(guó)總產(chǎn)量已突破40 萬(wàn)噸［7］，養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量實(shí)現(xiàn)了對(duì)美國(guó)的全面反超［8］，促使我國(guó)成為斑點(diǎn)叉尾鮰的主產(chǎn)國(guó)和主消費(fèi)國(guó)。

關(guān)于斑點(diǎn)叉尾鮰性別決定機(jī)制，目前普遍認(rèn)為其為雄性異配子型（XX/XY）［9］，且不存在異形性染色體［10］。迄今，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰性別決定基因以及性染色體鑒定已做過較多的研究。Bao 等［10］通過對(duì)YY 型和XX 型斑點(diǎn)叉尾鮰的基因組序列進(jìn)行比較研究，證實(shí)性別決定座位遺傳距離小于0.5 cM，物理距離為8.9 Mb，但X 和Y 染色體上并未發(fā)現(xiàn)與哺乳動(dòng)物Y染色體性別決定區(qū)基因（sex-determining region of Ychromosome，SRY）和鳥類double-sex 和mab-3 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（double-sex and mab-3 related transcription factor，DMRT）類似的性別特異基因。在之前的研究中，江蘇省淡水水產(chǎn)研究所斑點(diǎn)叉尾鮰課題組（本課題組）從斑點(diǎn)叉尾鮰性染色體上的zbtb38基因的編碼區(qū)鑒定到13 個(gè)性別連鎖單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）標(biāo)記，其中6 個(gè)替換分別導(dǎo)致X和Y 染色體上zbtb38基因氨基酸編碼發(fā)生改變［11］，推測(cè)其為斑點(diǎn)叉尾鮰重要的性別決定候選基因。

由于多克隆抗體具有多個(gè)抗原識(shí)別表位，能夠與特異性抗原緊密結(jié)合，在研究基因功能過程中發(fā)揮了重要的作用。目前，ZBTB38蛋白的商業(yè)多克隆抗體主要應(yīng)用于人（Homosapiens）、小鼠（Musmusculus）等哺乳動(dòng)物［12］，而在魚類中缺乏特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的該蛋白抗體，因此在魚類中開展ZBTB38 蛋白多克隆抗體制備研究，對(duì)于進(jìn)一步探究該基因的功能具有重要的意義。ZBTB38蛋白是一類分子量較大的蛋白（超過150 kDa），過大的分子量在原核生物中一般難以被誘導(dǎo)表達(dá)，或表達(dá)效率降低，且更容易形成包涵體［13］。為解決這一問題，通常的做法是利用較大蛋白的部分保守序列制備多克隆抗體，如人谷氨酰胺果糖6 磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶1（GFPT1）［14］、鯉魚SLC15A1［15］、環(huán)形泰勒蟲DnaJ［16］等蛋白多克隆抗體均是通過該策略制備而成。在本研究中，將zbtb38基因部分序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后連接至pET32a（+）載體以構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a（+）-zbtb38，利用原核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，免疫新西蘭白兔制備高效價(jià)兔源多克隆抗體，并使用該抗體利用免疫印跡（Western blot）技術(shù)檢測(cè)ZBTB38 蛋白在斑點(diǎn)叉尾鮰性腺組織中的表達(dá)水平，旨在為進(jìn)一步在蛋白水平研究斑點(diǎn)叉尾鮰zbtb38基因的功能建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

EscherichiacoliDH5α、E.coliBL21（DE3）、中分子質(zhì)量蛋白標(biāo)記（Marker）（14.4～94 kDa），購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；山羊抗兔-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）二抗、質(zhì)粒pET32a（+），購(gòu)自南京鐘鼎生物公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）、丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺（acrylamide-bisacrylamide，Acr-Bis）、三羥甲基氨基甲烷［Tris（hydroxymethyl）aminoethane，Tris］、弗氏佐劑，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；透析袋和0.22 μm無(wú)菌濾器，購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；四甲基乙二胺，購(gòu)自美國(guó)伯樂公司；Ni-NTA瓊脂糖親和填料，購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究院；RNA提取試劑盒、DNase I、PrimeScriptTMRT 試劑盒、SYBR?PrimeScript?Plus RT-PCR 試劑盒，購(gòu)自大連TaKaRa 公司；新西蘭實(shí)驗(yàn)兔由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；斑點(diǎn)叉尾鮰試驗(yàn)魚為本課題組培育。

1.2 試驗(yàn)儀器

Allegra 21R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN）；Centrifuge 5810 R 臺(tái)式高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；320-S pH計(jì)（美國(guó)Mettler Toledo）；AR5120電子天平（美國(guó)AHOΜS）；MultiTemp Ⅲ恒溫水浴鍋（美國(guó)Amersham Pharmacia）；SIM-F140AY65 雪花狀制冰機(jī)（日本SANYO）；SW-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)（中國(guó)蘇凈）；龍ETC-811 PCR 儀（中國(guó)東勝）；CFX96 熒光定量PCR 儀器；Mini-PROTEAN Tetra Cell 電泳儀（美國(guó)Bio-Rad）；Wellwash 4 MK2洗板機(jī)、Model 705超聲波細(xì)胞破碎儀、Q Exactive 質(zhì)譜儀、Dionex Ultimate 3000 RSLCnano 液相色譜、Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo）等。

1.3 pET32a（+）-zbtb38重組表達(dá)載體的構(gòu)建

由于原核生物蛋白表達(dá)具有密碼子偏好性，在構(gòu)建斑點(diǎn)叉尾鮰zbtb38基因原核表達(dá)載體前，利用MaxCodonTMOptimization Program（v13）軟件將其開放閱讀框（open reading frame，ORF）前1 239 bp序列優(yōu)化為適于原核表達(dá)的基因序列，且翻譯的蛋白序列不變，利用SMART軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析并繪制ZBTB38蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖。密碼子優(yōu)化的總原則為用宿主細(xì)胞中使用頻率高的同義密碼子替換外源mRNA序列中的密碼子，保證外源mRNA序列中的密碼子和宿主細(xì)胞的密碼子使用偏向性更加契合，避免出現(xiàn)稀有密碼子，同時(shí)規(guī)避目標(biāo)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。使用Clustal Omega多序列比對(duì)軟件（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）比較優(yōu)化前后zbtb38基因序列。直接合成優(yōu)化后的基因序列，在兩端添加含有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)序列，并在基因序列3′端添加6× Histag 序列，基因合成委托南京金斯瑞公司完成，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因序列大小。用NdeI和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)pET-32a（+）質(zhì)粒和合成的基因序列進(jìn)行雙酶切，之后將zbtb38基因連接到pET-32a（+）載體中。將pET32a（+）-zbtb38 原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，并進(jìn)行PCR菌落鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 重組ZBTB38蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）中，菌落PCR 鑒定陽(yáng)性菌落后，取含重組質(zhì)粒的菌液50 μL，接種至溶菌肉湯（lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基中（含卡那霉素），在37 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)4 h 后，用0.2 mmol·L-1IPTG 在16 ℃、200 r·min-1條件下過夜誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）鑒定成功表達(dá)后，對(duì)菌體進(jìn)行超聲破碎；4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心30 min 后收集沉淀，使用12% SDS-PAGE鑒定，考馬斯亮藍(lán)染色。

利用低壓層析系統(tǒng)，上清溶液以0.5 mL·min-1流速上樣至Ni-IDA-Sepharose Cl-6B親和層析柱（上樣前層析柱經(jīng)Ni-IDA Binding-Buffer 預(yù)平衡），以0.5 mL·min-1流速?zèng)_洗，直至流出液的280 nm 吸光值（OD280）到達(dá)基線。然后用Ni-IDA Washing-Buffer 以1 mL·min-1流速?zèng)_洗，至流出液的OD280值到達(dá)基線。再用Ni-IDA Elution-Buffer 以1 mL·min-1流速洗脫目的蛋白，收集流出液。收集上述蛋白流出液加入透析袋中，并用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液透析過夜，最后使用12% SDS-PAGE鑒定目的蛋白。

1.5 重組ZBTB38蛋白鑒定

采用三種方法對(duì)純化后的重組蛋白進(jìn)行鑒定：（1）以0.5 mg·mL-1牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，使用12% SDS-PAGE 鑒定純化后的ZBTB38 蛋白；（2）使用Western blot 方法，以Anti-His Tag抗體檢測(cè)帶有His標(biāo)簽的重組ZBTB38蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)重組蛋白的敏感檢測(cè)；（3）使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph-mass spectrometer，LCMS）精準(zhǔn)鑒定重組ZBTB38 蛋白，具體過程為重組蛋白切膠回收后經(jīng)水洗、脫色、脫水、烷基化、水洗、脫水等系列步驟后，用胰蛋白酶酶切重組ZBTB38 蛋白，進(jìn)一步超聲破碎后并提取肽段，肽段用樣品溶解液（0.1%甲酸、2%乙腈）溶解，用冷凍離心機(jī)在4 ℃、13 200 r·min-1條件下離心20 min，取上清液利用LCMS 技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。使用MM File Conversion軟件處理質(zhì)譜原始下機(jī)文件，然后用MASCOT 軟件（http：//www.matrixscience.com/）在uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索。肽段在質(zhì)譜儀中離子化后，會(huì)帶上一定量的電荷，通過檢測(cè)器分析，可得到各肽段的質(zhì)荷比（m/z），從而得知各肽段的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.6 重組ZBTB38蛋白多克隆抗體的制備及鑒定

已純化的重組ZBTB38蛋白進(jìn)行二喹啉甲酸（BCA）濃度測(cè)定后，與等量的完全弗氏佐劑混合，充分乳化后，進(jìn)行兔源多克隆抗體制備。分3 次免疫，14～21 d免疫1 次，每次400 μg 皮下免疫。第3 次免疫后，于第7 天采血，并根據(jù)間接酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法確定抗血清針對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰ZBTB38 蛋白的效價(jià)，當(dāng)抗血清效價(jià)大于1∶50 000時(shí)采血制備最終抗血清。制備成抗原親和純化層析柱：ZBTB38 重組蛋白與瓊脂糖介質(zhì)偶聯(lián)，將上述抗血清與PBS溶液等量混合后緩慢上樣；用甘氨酸洗脫緩沖液洗脫層析柱，收集洗脫液。在PBS溶液中4 ℃過夜透析層析柱，隔日檢測(cè)抗體的純度、濃度以及效價(jià)。

采用BCA 濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定抗體濃度；使用12% SDS-PAGE電泳后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，以鑒定抗體純度。通過間接ELISA 檢測(cè)純化抗體的效價(jià)，操作過程參見文獻(xiàn)［17］。將相應(yīng)稀釋度的稀釋液在450 nm吸光值/陰性吸光值＞2.1定為抗體的效價(jià)。

1.7 性腺組織ZBTB38蛋白和基因表達(dá)檢測(cè)

分別取斑點(diǎn)叉尾鮰精巢和卵巢組織各0.5 g，用RIPA 裂解液提取總蛋白，經(jīng)BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，加入上樣緩沖液后煮沸5 min，14 000 r·min-1離心5 min，取上清液進(jìn)行Western blot檢測(cè)，使用H3組蛋白作為內(nèi)參［18］。

分別取斑點(diǎn)叉尾鮰精巢和卵巢組織50 mg，使用RNA 提取試劑盒提取總RNA；使用DNase I 去除基因組DNA，并檢測(cè)RNA 濃度和質(zhì)量。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit 將肝臟中提取的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）引物，以αtubulin基因作為內(nèi)參基因［19］，引物序列如表1所示。使用SYBR?PrimeScript?Plus RT-PCR 試劑盒進(jìn)行qRTPCR。根據(jù)2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，定量數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，利用t檢驗(yàn)進(jìn)行基因表達(dá)差異性分析。

表1 qRT-PCR反應(yīng)檢測(cè)基因表達(dá)所用的引物信息Table 1 The primers for qRT-PCR used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的鑒定

斑點(diǎn)叉尾鮰zbtb38基因ORF 前1 239 bp 序列編碼的蛋白序列包含BTB結(jié)構(gòu)域、2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)（圖1-A），優(yōu)化后的zbtb38基因序列與原序列的比對(duì)情況如圖1-B所示。其中，236個(gè)密碼子的1個(gè)堿基發(fā)生改變（第1位11 個(gè)、第3 位225 個(gè)），19 個(gè)密碼子的兩個(gè)堿基發(fā)生改變（第1 和第2 位9 個(gè)、第1 和第3 位10 個(gè)），27 個(gè)密碼子的3 個(gè)堿基均發(fā)生改變。人工合成優(yōu)化后的斑點(diǎn)叉尾鮰zbtb38基因片段，并與pET32a（+）載體一同進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切，酶切過后的載體與目的基因形成重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)菌落PCR和測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的序列一致，說明重組載體pET32a（+）-zbtb38 質(zhì)粒構(gòu)建成功，兩種序列的部分測(cè)序峰圖如圖1-C所示。

圖1 斑點(diǎn)叉尾鮰zbtb38基因及蛋白序列Fig.1 zbtb38 gene and protein sequence of channel catfish

2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化

將測(cè)序正確的pET32a（+）-zbtb38 重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21（DE3）表達(dá)菌株中，以空載體pET32a（DE3）作為對(duì)照。SDS-PAGE 結(jié)果顯示相對(duì)于未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的E.coliBL21（DE3）大腸桿菌，經(jīng)過IPTG 誘導(dǎo)后，在45 kDa 上方出現(xiàn)特異性目的條帶（圖2-A），但目的蛋白比預(yù)測(cè)的分子量（46.34 kDa）略大，可能是蛋白表達(dá)后進(jìn)行了翻譯后修飾或蛋白質(zhì)折疊。大批量誘導(dǎo)后的E.coliBL21（DE3）大腸桿菌經(jīng)過高壓破碎和純化，得到了特異的單一條帶（圖2-B），表明成功表達(dá)出重組ZBTB38蛋白。

圖2 重組蛋白表達(dá)與純化的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of expressed and purified recombinant ZBTB38 protein

2.3 重組蛋白的鑒定

根據(jù)SDS-PAGE（圖3-A）和Western blot（圖3-B）鑒定結(jié)果進(jìn)一步證明了重組ZBTB38 蛋白分子量比理論分子量偏大，故采用LC-MS 進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。檢索軟件根據(jù)肽段二級(jí)質(zhì)譜信息與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)合匹配度打分及錯(cuò)配過濾，得到肽段的確切序列，進(jìn)而拼接出蛋白的完整序列。經(jīng)液相質(zhì)譜檢測(cè)，重組ZBTB38 蛋白序列與預(yù)期一致。

圖3 重組蛋白質(zhì)檢分析Fig.3 Quality control of recombinant ZBTB38 protein

2.4 重組ZBTB38蛋白多克隆抗體鑒定

第3 次加強(qiáng)免疫后，采集兔血清，間接ELISA 檢測(cè)檢測(cè)血清中特異性抗體的效價(jià)，當(dāng)樣品吸光值/陰性吸光值＞2.1 即認(rèn)為是陽(yáng)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所得血清效價(jià)可達(dá)1∶512 000（圖4-A）。已純化的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，可見兔抗斑點(diǎn)叉尾鮰ZBTB38蛋白多克隆抗體重鏈為55 kDa（圖4-B），純度在85%以上。BCA 法測(cè)得抗體濃度為0.42 mg·mL-1，抗體得率達(dá)到5.04 mg。表明以斑點(diǎn)叉尾鮰重組ZBTB38 蛋白為免疫原，制備出了高效價(jià)的特異性多克隆抗體。

圖4 重組ZBTB38蛋白多克隆抗體鑒定Fig.4 Identification of polyclonal antibody of recombinant protein

2.5 qRT-PCR 和Western blot 對(duì)zbtb38 基因的比較分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證制備的抗體的有效性，用兔抗斑點(diǎn)叉尾鮰ZBTB38 抗體檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰精巢和卵巢組織中ZBTB38 蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖5-A 所示。ZBTB38蛋白在精巢組織中表達(dá)量最高，而在卵巢中的表達(dá)量最低。同時(shí)，為了驗(yàn)證上述結(jié)果，采用qRTPCR 方法檢測(cè)了精巢和卵巢組織中zbtb38基因的表達(dá)水平，精巢組織中zbtb38基因的表達(dá)水平極顯著高于卵巢，結(jié)果與Western blot檢測(cè)結(jié)果一致（圖5-B）。

圖5 斑點(diǎn)叉尾鮰zbtb38基因在精巢和卵巢組織中的表達(dá)分析Fig.5 Expression patterns of zbtb38 gene and protein in testis and ovary of channel catfish

3 討論

為了深入研究斑點(diǎn)叉尾鮰zbtb38基因的功能，本研究首先制備了含有ZBTB38 蛋白N 端413 個(gè)氨基酸序列的重組蛋白，并以此重組蛋白作為抗原免疫動(dòng)物獲得了特異性較強(qiáng)、效價(jià)較高的多克隆抗體。制備的兔抗斑點(diǎn)叉尾鮰ZBTB38 蛋白多克隆抗體能特異性識(shí)別性腺組織中的ZBTB38蛋白。

在本研究中，將斑點(diǎn)叉尾鮰zbtb38基因序列優(yōu)化為適于原核表達(dá)的基因序列，因?yàn)椴煌锓N對(duì)同義密碼子的使用頻率往往不同。在外源基因的同義密碼子使用頻率與表達(dá)宿主相匹配的情況下，外源基因的表達(dá)水平會(huì)顯著提高［20］。因此，利用原核生物表達(dá)真核生物基因時(shí)進(jìn)行密碼子優(yōu)化是十分必要的，經(jīng)過優(yōu)化的基因序列能提高mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，避免因tRNA不充足導(dǎo)致翻譯延遲、移碼、終止，以及氨基酸錯(cuò)配等情況發(fā)生。趙茜［21］在進(jìn)行金魚（Carassiusauratus）Tgf2 轉(zhuǎn)座酶原核表達(dá)研究時(shí)，依據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的簡(jiǎn)并性和偏好性對(duì)金魚Tgf2 轉(zhuǎn)座酶的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，不僅增加了重組蛋白表達(dá)量，而且純度也得到了提高。

本研究通過牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品SDS-PAGE以及Western blot 等方法對(duì)表達(dá)的目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其實(shí)際分子量相較于理論分子量偏大，進(jìn)一步的質(zhì)譜鑒定證明獲得的蛋白確實(shí)為目標(biāo)蛋白。對(duì)于分子量偏差的原因可能是：（1）ZBTB38 蛋白N 端413 個(gè)氨基酸與6×His-tag 組成的重組蛋白等電點(diǎn)為7.45，堿性蛋白與SDS 形成復(fù)合物后，仍含有大量緊密的螺旋結(jié)構(gòu)［22］，而不是松散的無(wú)規(guī)則卷曲，較為緊密的構(gòu)型使復(fù)合物在凝膠中有更小的阻力，因此遷移更快；（2）重組蛋白具有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，仍具有鋅離子結(jié)合能力［23］，從而使其帶有較高的正電荷，為中和正電荷，蛋白通常會(huì)經(jīng)歷蛋白修飾（如糖基化、乙酰化修飾等），結(jié)合的大量鋅離子和各種修飾導(dǎo)致分子量偏大。

多項(xiàng)研究表明，ZBTB 家族基因在哺乳動(dòng)物性腺分化和發(fā)育過程中具有重要的作用。哺乳動(dòng)物性別決定基因SRY上游調(diào)控區(qū)序列包含一個(gè)BTB-zinc finger 結(jié)合位點(diǎn)，這意味著SRY基因受到ZBTB 蛋白家族的調(diào)控［24］。利用同源重組技術(shù)將小鼠plzf（zbtb16）基因第二外顯子敲除后，其睪丸變小，成年期精原細(xì)胞逐漸消失，精子形成過程發(fā)生阻斷［25］。而bcl6（zbtb27）基因缺陷型小鼠精子數(shù)目比plzf缺陷小鼠更少，且精母細(xì)胞在減數(shù)分裂中期的I 時(shí)期凋亡程度更大［26］。同為ZBTB 家族的fru基因能夠調(diào)控果蠅（Drosophila melanogaster）的求偶行為，fru基因的變異會(huì)導(dǎo)致果蠅求偶對(duì)象發(fā)生改變［27］。與ZBTB38高度同源的Kaiso蛋白（ZBTB33）在調(diào)控細(xì)胞凋亡時(shí)，與野生型p53 蛋白結(jié)合會(huì)激活細(xì)胞凋亡通路上的相關(guān)基因［28］，而與突變型p53 蛋白結(jié)合會(huì)抑制細(xì)胞凋亡通路上的相關(guān)基因［29］。Kaiso 蛋白通過其鋅指結(jié)構(gòu)域識(shí)別并調(diào)控N-CoR［30］、Rapsyn［31］、BRCA1［32］等蛋白，以及WNT/β-Catenin［33］、TGF-β［34］等信號(hào)通路參與的生物學(xué)過程，其中大多數(shù)蛋白和信號(hào)通路均參與不同物種的性別決定過程。在本研究中，使用制備的兔抗斑點(diǎn)叉尾鮰ZBTB38蛋白抗體并結(jié)合qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)了zbtb38基因及其編碼的蛋白在斑點(diǎn)叉尾鮰性腺組織中的表達(dá)水平，結(jié)果表明精巢組織中zbtb38基因的表達(dá)水平極顯著高于卵巢，結(jié)果與Wu 等［35］在點(diǎn)帶石斑魚（Epinephelus coioides）中關(guān)于zbtb40基因的研究結(jié)果較為一致。說明zbtb38基因及其家族基因在魚類性別決定和維持等方面具有重要的作用。

4 結(jié)論

本研究基于密碼子的簡(jiǎn)并性和偏好性原則，優(yōu)化斑點(diǎn)叉尾鮰zbtb38基因部分編碼序列，成功構(gòu)建了其原核表達(dá)載體pET32a（+）-zbtb38。通過原核表達(dá)系統(tǒng)E.coliBL21 （DE3）誘導(dǎo)表達(dá)出ZBTB38 重組蛋白，利用重組蛋白制備了效價(jià)高、特異性強(qiáng)的兔抗斑點(diǎn)叉尾鮰ZBTB38 蛋白多克隆抗體。應(yīng)用該抗體檢測(cè)了ZBTB38蛋白在斑點(diǎn)叉尾鮰性腺組織中的表達(dá)水平，證明其在精巢中的表達(dá)水平顯著高于卵巢。