單細胞測序和空間轉錄組技術在口腔醫(yī)學的應用進展

張夏桐,吳文治,陳 卓

隨著生物信息學、材料科學和計算機科學的飛速發(fā)展,高通量測序技術出現(xiàn)了巨大的進步。傳統(tǒng)的RNA-seq測序(bulk RNA-seq)通過從組織或細胞中提取RNA,將所有的RNA混合進行測序,所獲得的是整個細胞群體中基因表達水平,無法研究組織內(nèi)細胞的異質(zhì)性;單細胞RNA測序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)對單個細胞進行高通量和高分辨率的組學分析,能夠鑒定異質(zhì)細胞群體、重建細胞發(fā)育軌跡、模擬基因轉錄動力學以及推斷基因調(diào)控網(wǎng)絡。但是單細胞RNA測序的數(shù)據(jù)不能反映細胞的空間信息,而空間轉錄組(spatial transcripto-mics,ST)技術能將組織內(nèi)不同細胞的基因表達信息定位到組織的原始空間位置上,進而能直觀觀測到組織中不同部位基因表達的差異。空間轉錄組技術通過成像和測序的結合,能夠彌補單細胞測序的不足。單細胞測序技術在口腔醫(yī)學領域已有很多研究,其與空間轉錄組的結合也逐漸受到關注。本文主要綜述了單細胞測序和空間轉錄組技術在口腔醫(yī)學領域的研究應用及主要進展。

1 單細胞測序技術概況

單細胞測序技術首先由Tang等[1]報道,對單個細胞遺傳物質(zhì)均勻擴增、標記建庫后進行測序,主要步驟為單細胞分選、核酸提取、文庫構建、高通量測序和數(shù)據(jù)分析等,包括單細胞轉錄組、基因組、表觀組和代謝組測序等,目前已在生命科學等領域廣泛應用。近年來,以單組學技術為基礎的單細胞多組學技術[2]能在同一細胞中捕獲多個組學信息,從而更全面地反映細胞特性及其分子機制。如聯(lián)合單細胞轉錄組和表觀組的雙組學技術,包括scM&T-seq技術[3]、SNARE-seq技術[4]、scCAT-seq技術等[5],從而進一步揭示細胞遺傳信息及基因表達變異對細胞變化的影響;聯(lián)合單細胞轉錄組和蛋白組的雙組學技術,包括REAP-seq技術[6]、CITE-seq技術等[7],提供了更為精確的蛋白表達差異。相比較于單組學數(shù)據(jù),多組學技術提供了更為全面、準確的生物信息,也是單細胞分析技術的發(fā)展趨勢。

2 空間轉錄組技術概況

2016年,Joakim Lundeberg課題組[8]首次提出了空間轉錄組的概念,空間轉錄組技術[9]能夠獲得組織樣本中不同空間位置的轉錄組數(shù)據(jù)信息,在單細胞測序的基礎上進一步鑒定和區(qū)分功能基因在不同的空間位置上的表達,2020年被Nature Methods評為年度技術[10]。當前,根據(jù)空間轉錄組技術獲取空間信息的原理不同,主要分為基于原位捕獲和測序的空間轉錄組學技術,基于顯微切割的空間轉錄組學技術和基于原位雜交的空間轉錄學技術等。其中,激光捕獲顯微切割術(laser capture microdissection,LCM)利用激光束切除識別組織區(qū)域,其精確性高便捷性好,被廣泛應用于活細胞、新鮮冷凍組織等。Chen等[11]將激光捕獲顯微切割術與單細胞RNA測序技術結合,通過整合與優(yōu)化單細胞測序和激光顯微切割技術,構建了一種能夠獲得少量細胞轉錄組信息、同時保留細胞原有位置信息的測序方法,這一技術又稱為Geo-seq(geographical position sequencing)。此外,原位雜交技術常用的包括MERFISH[12](multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization)和seqFISH等技術[13]。Eng等[14]基于原有的seqFISH技術,設計了一種可以檢測到單個細胞內(nèi)10 000個基因的超高成像技術,被稱為seqFISH+。與seqFISH技術相比,其成像效率提高了8倍,具有高通量、高精度和亞衍射極限分辨率的特點,是揭示基因空間信息的重要研究技術。

3 單細胞測序與空間轉錄組的聯(lián)合應用

隨著單細胞測序技術的發(fā)展成熟,空間轉錄組技術在分辨率和通量上也得到了大幅度提升。如表1所示,空間轉錄組技術能夠捕獲細胞的空間位置信息及相關的基因表達數(shù)據(jù),但是目前無法達到單細胞分辨率,而單細胞測序技術能夠在單個細胞水平構建各個細胞的表達譜及其基因表達,卻丟失了細胞的原始空間分布及通信網(wǎng)絡。兩者的結合實現(xiàn)互補,能夠在單細胞水平描繪組織的空間圖譜及細胞的空間交互。目前,將單細胞數(shù)據(jù)和空間轉錄組數(shù)據(jù)整合的方法主要包括兩種:去卷積[15](deconvolution)和映射[16](mapping)。去卷積是指從單個空間捕獲點中根據(jù)單細胞數(shù)據(jù)分離出離散的細胞亞型,而映射是指將單細胞數(shù)據(jù)定位到HPRI(high-plex RNA imaging)圖譜上或組織的特定區(qū)域中。隨著空間轉錄組技術的更迭與發(fā)展,可以根據(jù)不同的實驗需要整合各種空間轉錄組技術與單細胞測序數(shù)據(jù),在空間上揭示組織單細胞水平的全轉錄組信息,以進一步描繪組織發(fā)生發(fā)育與疾病微環(huán)境中的特定細胞亞群及其空間位置上的通信網(wǎng)絡。

表1 單細胞測序與空間轉錄組技術的原理與特點

4 單細胞測序和空間轉錄組技術在口腔醫(yī)學領域的應用現(xiàn)狀

口腔醫(yī)學領域對測序技術的要求具有特殊性,主要表現(xiàn)為口腔組織如牙周、牙髓組織量較小,在傳統(tǒng)測序背景下,組織樣本量及樣本活性較難達到要求,且口腔微生物菌群較復雜、難以實驗室培養(yǎng)、對微生物的測序分析尚存在困難。而單細胞測序技術能突破傳統(tǒng)測序的局限,使口腔組織的測序更為精確便捷。目前,隨著測序技術的進展,常將單細胞測序技術與空間轉錄組技術結合,以獲得高通量水平的單細胞分子信息及空間位置信息。在口腔醫(yī)學領域,主要應用于口腔間充質(zhì)干細胞、口腔微生物、口腔組織發(fā)生發(fā)育和多種口腔疾病的研究中。

4.1 口腔間充質(zhì)干細胞

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有自我更新能力的基質(zhì)細胞[17]。口腔間充質(zhì)干細胞包括牙周干細胞、牙髓干細胞、牙齦干細胞、來源于脫落乳牙的干細胞以及牙乳頭干細胞等[18]。間充質(zhì)干細胞具有異質(zhì)性,表現(xiàn)在不同供體、不同組織來源、克隆亞群以及單細胞水平,而傳統(tǒng)的bulk測序難以區(qū)分出細胞亞群、揭示細胞的異質(zhì)性。

單細胞轉錄組測序作為研究干細胞異質(zhì)性的重要手段,在口腔間充質(zhì)干細胞領域已有初步應用。牙周膜干細胞及牙髓干細胞是口腔間充質(zhì)干細胞的重要組成部分,Pagella等[19]通過單細胞轉錄組測序發(fā)現(xiàn)兩者具有極相似的分子特性,相比于其他亞群更高表達MYH1和THY1。而兩者的主要差別表現(xiàn)在牙周MSCs中高表達CCL2和編碼膠原蛋白的基因及SPARC/Osteonectin,這表明牙周微環(huán)境有利于MSCs向成纖維細胞樣分化,而牙髓MSCs中高表達CXCL14和RARRES1及KRT18,表明牙髓微環(huán)境中有利于MSCs的成骨分化。此外,Lee等[20]發(fā)現(xiàn)人牙髓干細胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)主要表現(xiàn)為具有成骨分化潛能及成神經(jīng)分化潛能的亞群,并且高表達神經(jīng)和內(nèi)源系統(tǒng)相關基因;而人牙周膜干細胞(human dental periodontal ligament cells,hPDLSCs)主要為具有成肌分化潛能和成骨分化潛能的亞群,高表達成骨和成軟骨基因。

除了對牙髓、牙周膜干細胞進行單細胞分析外,單細胞測序也應用于頜骨骨髓干細胞及其與骨免疫微環(huán)境的相關研究。Lin等[21]發(fā)現(xiàn)與長骨相比,牙槽骨中的免疫微環(huán)境更為活躍,免疫細胞的占比也更高。在牙槽骨的免疫細胞亞群中,單核/巨噬細胞亞群與間充質(zhì)干細胞亞群的聯(lián)系最為密切,在長骨中,單核/巨噬細胞更高表達抑瘤素M以促進MSCs的成骨分化且抑制MSCs的成脂分化。

目前,單細胞測序技術在口腔間充質(zhì)干細胞中的應用主要集中在干細胞亞群的區(qū)分及生物信息分析,值得注意的是,在疾病微環(huán)境下,干細胞的異質(zhì)性是否會發(fā)生變化,干細胞與其他細胞之間的通信是否會受到影響,尚需要進一步的研究。

4.2 口腔微生物

口腔微生物群是僅次于腸道微生物群的第二復雜的人體微生物群落,包含700種細菌,也包括真菌、病毒等[22]。口腔微生物群與宿主的口腔健康及全身健康或疾病密切相關。研究表明口腔微生物與齲齒、牙周病、口臭等口腔問題關系密切,同樣也和心血管疾病、糖尿病等全身系統(tǒng)性疾病的發(fā)生發(fā)展有關。傳統(tǒng)的口腔微生物測序方法主要是以16S核糖體核糖核酸基因特征區(qū)域測序和宏基因組測序為主,但是其提供的生物學信息有限,尚難以對不易培養(yǎng)的微生物進行測序。

近年來,隨著單細胞測序技術的發(fā)展,其在微生物領域的應用也日益普遍。Cross等[23]應用單細胞測序和反向基因組學的方法培養(yǎng)了人口腔Sacchari bacteria菌門(TM7)的三個不同菌種,發(fā)現(xiàn)其均為放線菌的體表寄生物種,并且利用相同的方法,分離并培養(yǎng)出了一種先前無法培養(yǎng)的人口腔細菌SR1。Campbell等[24]通過單細胞基因組學測序首次從牙周炎患者口內(nèi)分離出綠灣菌。Beall等[25]通過單細胞測序發(fā)現(xiàn)了與福賽坦納菌親緣關系相近的坦納菌BU063和坦納菌BU045,其中坦納菌BU063主要存在于健康牙周組織中,而坦納菌BU045則和牙周炎的發(fā)展密切相關,為慢性牙周炎發(fā)病機制提供了新依據(jù)。口腔脫硫菌作為一種新的牙周致病菌,屬于難以分離培養(yǎng)的口腔微生物,傳統(tǒng)方法是通過硫酸鹽還原生理學的原理,在純培養(yǎng)中富集并隨后分離而得,而Cross等[26]根據(jù)單細胞基因組數(shù)據(jù)分析微生物的生理特性分離出了口腔脫硫菌,并發(fā)現(xiàn)口腔脫硫菌主要依賴梭桿菌產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)生長,其毒性及促炎特性也是由其他的口腔微生物轉移獲得。

由于微生物的體積較小、存在細胞壁且mRNA缺乏polyA尾等因素,使得對細菌等微生物的測序存在一定的局限性。目前,針對原核細胞RNA的測序方法包括Split-pool[27]和BacDrop[28]等,分別刊登在Science和Cell上。隨著微生物單細胞測序(MsRNA-seq)的更新及應用,細菌群體耐藥、細菌與宿主相互作用及微生物時序表達等研究在未來會取得新的突破。特別在口腔微生物領域,可應用于如單個牙周致病菌與宿主之間的相互作用機制、齲病致病菌的時序表達差異等,進一步揭示口腔微生物的致病機制及其與宿主之間的相互作用關系。雖然目前尚無口腔微生物的空間轉錄組測序,新的高通量空間轉錄組成像方法已能觀察銅綠假單胞菌生物膜在微尺度上的空間信息[29]。

4.3 口腔組織發(fā)生發(fā)育

牙發(fā)育依賴于來自顱神經(jīng)嵴的間充質(zhì)細胞和來源于外胚層的上皮細胞相互作用,原發(fā)性上皮帶增厚向結締組織內(nèi)增生,其周圍的間充質(zhì)聚集形成上皮芽最終發(fā)育成釉質(zhì)、牙本質(zhì)、牙髓和牙周膜。在這一過程中,大量信號分子參與形成復雜調(diào)控網(wǎng)絡[30]。

目前,單細胞測序已被廣泛應用于揭示牙發(fā)育的軌跡以及發(fā)育過程中的細胞間通信。Shi等[31]通過對未成熟恒牙牙胚進行單細胞測序,發(fā)現(xiàn)免疫細胞占大多數(shù),并通過分泌轉化生長因子-β、腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素-1調(diào)節(jié)其他細胞。Matsubara等[32]借助成像技術,在單細胞水平上可視化牙齒血管系統(tǒng)的3D結構,鑒定出一種獨特牙周尖樣內(nèi)皮細胞,其參與牙本質(zhì)生成及牙齒礦化過程。在成牙本質(zhì)細胞的控制下,牙周尖樣內(nèi)皮細胞表現(xiàn)出較高的血管生成活性和可塑性,正反饋促進成牙本質(zhì)細胞的成熟。以上研究表明,單細胞測序有助于探究牙發(fā)育過程中牙本質(zhì)分泌礦化與血管、神經(jīng)和免疫細胞發(fā)育的耦聯(lián)。

此外,單細胞測序也有助于進一步揭示調(diào)控牙發(fā)育的關鍵基因及信號通路。Chiba等[33]結合使用單細胞RNA測序及CAGE-seq技術鑒定參與牙齒發(fā)育的基因,發(fā)現(xiàn)成釉細胞新標記基因FXYD4和ACPP,在成釉細胞的分化過程中發(fā)揮重要的功能。神經(jīng)嵴細胞是頜面部生長發(fā)育的基礎,但是其遷移分化等具體機制尚不清楚,Jing等[34]選取不同發(fā)育階段的小鼠磨牙進行分析,發(fā)現(xiàn)IGF信號介導的細胞間相互作用擾亂了牙周膜細胞的發(fā)育,并且發(fā)現(xiàn)關鍵調(diào)節(jié)因子Foxp4的缺失可導致牙周膜細胞的發(fā)育缺陷。Takada等[35]發(fā)現(xiàn)轉錄因子Mkx通過調(diào)節(jié)特定細胞群和基因表達來維持牙周膜內(nèi)的平衡,并且在Mkx缺失的牙周膜中間充質(zhì)細胞和成骨細胞中的骨化相關基因表達增高且巨噬細胞和炎癥介質(zhì)數(shù)量增加。

目前空間轉錄組技術尚未應用于牙發(fā)育的研究,主要是由于當前的空間轉錄組以基于新鮮的超薄冷凍組織切片為主,牙和骨等硬組織的冷凍切片和組織透明化存在難度,導致分辨率和基因檢測效率不足。然而隨著針對石蠟組織切片的空間轉錄測序技術的突破[36],未來這一方面的研究將獲得更多的關注。

4.4 口腔疾病

4.4.1 牙周炎

在牙周炎發(fā)生發(fā)展的過程中,宿主的免疫炎癥反應是決定其嚴重程度的重要因素。Lee等[37]通過構建牙周炎患者及健康對照組外周血單核細胞表達譜,發(fā)現(xiàn)在牙周炎疾病狀態(tài)下,CRIP1可作為特異性全身炎癥指標在各細胞類型中明顯增加,同時BTLA和IFNG信號網(wǎng)絡在疾病狀態(tài)下也明顯增強。Qian等[38]通過對牙周炎患者及健康人群的牙周組織進行單細胞分析發(fā)現(xiàn)表達HLA-DR的內(nèi)皮細胞和CXCL13+的成纖維細胞與宿主免疫調(diào)節(jié)密切相關,而促炎性NLRP3+巨噬細胞在牙周炎進展中發(fā)揮重要作用。Chen等[39]構建了牙周骨免疫微環(huán)境的細胞圖譜以進一步觀察在牙周炎疾病背景下骨免疫細胞類型的改變,發(fā)現(xiàn)牙周炎患者中高表達趨化因子的TNFRSF21+成纖維細胞富集,而隨著牙周基礎治療的進行,CD55+間充質(zhì)干細胞、APOE+前成骨細胞和IBSP+成骨細胞逐漸降低。此外,Caetano等[40]發(fā)現(xiàn)在牙周炎環(huán)境中巨噬細胞比其他細胞表達更高的相關易感基因,如IL1B、PTGS2/COX2、FCGR2A、IL10 和IL1A等在巨噬細胞亞群中有更為特異性的表達。而對于患有全身系統(tǒng)性疾病的牙周炎患者,其機體的免疫應答也有所不同。Agrafioti等[41]通過研究患有或不患有2型糖尿病的牙周炎患者,發(fā)現(xiàn)患有2型糖尿病的牙周炎患者巨噬細胞中高表達NF-κB轉錄因子復合物亞單位RELA,這表明巨噬細胞在牙周炎中的異質(zhì)性和過度活化可能與牙周炎的發(fā)病機制及進展相關,并可能在2型糖尿病患者中進一步增強。

單細胞測序技術雖能鑒別健康及炎癥牙周組織中的基因表達差異,但是尚不能將基因表達定位到特定的細胞區(qū)域。Lundmark等[42]聯(lián)合應用單細胞測序與空間轉錄組技術,在高通量的水平定量且定位了牙周炎時牙齦組織中的基因表達,發(fā)現(xiàn)上皮及結締組織炎性浸潤區(qū)和非浸潤區(qū)三個區(qū)域的基因表達差異,其中在結締組織炎性浸潤區(qū)中IGLL5、SSR4、M2B1、XBP1四個基因表達上調(diào)最為明顯。

4.4.2 口腔癌

腫瘤異質(zhì)性普遍存在于腫瘤細胞間,同一腫瘤內(nèi)存在不同的細胞亞型,表現(xiàn)為細胞形態(tài)、基因表達、增殖和轉移潛力不同,其通過與腫瘤微環(huán)境相互作用促使腫瘤分化形成不同細胞亞型并發(fā)生轉移擴散。因此,了解腫瘤細胞的異質(zhì)性及腫瘤微環(huán)境對腫瘤的診斷、明確腫瘤性質(zhì)以及針對性治療均有重要影響。

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)作為頭頸部鱗狀細胞癌中最常見的亞型,其診斷及防治是口腔癌診療的關鍵。單細胞技術已被應用于探究OSCC中的腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性。已知在上皮癌發(fā)生發(fā)展過程中,部分上皮-間充質(zhì)轉化(partial epithelial-mesenchymal transition,p-EMT)是上皮-間充質(zhì)轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的中間狀態(tài),此時癌細胞同時表現(xiàn)出間充質(zhì)和上皮特征[43]。Huynh等[44]通過整合分析OSCC的單細胞數(shù)據(jù),探究腫瘤微環(huán)境中p-EMT亞群以及與其密切相關的癌相關成纖維細胞亞群間的細胞通信網(wǎng)絡,發(fā)現(xiàn)兩者之間的靶向性受配體交互作用與OSCC的轉移狀態(tài)有關。Puram等[45]通過對比分析未治療的OSCC原發(fā)性腫瘤以及已發(fā)生淋巴結轉移腫瘤的單細胞數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)惡性細胞在表達與細胞周期、應激、缺氧、上皮分化和部分上皮-間充質(zhì)(p-EMT)轉化相關的信號方面有所差異,這進一步提示p-EMT可作為淋巴結轉移、分級和不良病理特征的獨立預測因素。Chen等[46]從OSCC患者的腫瘤和鄰近正常組織中分離出T細胞進行測序鑒定并描繪了它們的發(fā)育軌跡,發(fā)現(xiàn)在OSCC腫瘤中可見耗竭CD8+T細胞和調(diào)節(jié)性CD4+T細胞富集,且TOX是腫瘤微環(huán)境中T細胞功能障礙的關鍵調(diào)節(jié)因子并參與介導腫瘤免疫抑制。Hsieh等[47]發(fā)現(xiàn)在白念珠菌感染的情況下OSCC的癌變機制與未感染者不同,在無白念珠菌感染的OSCC中,IL2/STAT5、TNFα/NFκB和TGFβ信號通路是其主要癌變機制,而有白念珠菌感染的情況下可發(fā)現(xiàn)KRAS信號通路和E2F下游靶基因,Stratifin是感染白念珠菌OSCC的特異性標志物。因此,單細胞測序不僅為理解OSCC的發(fā)生、發(fā)展機制提供了新策略,還為OSCC的檢測、分類和預后分析提供了新依據(jù)。

口腔鱗狀細胞癌具有神經(jīng)周浸潤(perineural invasion,PNI)特性,但尚未有明確的PNI診斷標準。Schmitd Ligia等[48]利用空間轉錄組技術分析了PNI陽性與PNI陰性患者神經(jīng)的轉錄組學特征,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)與腫瘤之間的距離不同其基因表達也有差異,這進一步證明了PNI是無淋巴結轉移患者預后不良的獨立預測因子,且神經(jīng)-腫瘤距離越近預后越差,這些結果也支持基于神經(jīng)-腫瘤距離對PNI的分類。單細胞測序和空間轉錄組的應用為挖掘時空特異性的口腔癌標志物和治療靶標提供了可行性。

4.4.3 口腔黏膜病

口腔黏膜由上皮及上皮下結締組織構成,作為人體的第一道防線,主要功能是屏障、感覺及分泌功能,其中,黏膜的保護屏障功能尤為重要。口腔黏膜屏障包括理化屏障和免疫屏障,主要由上皮細胞及免疫細胞維持,同時,基質(zhì)細胞也發(fā)揮著重要功能。因此,口腔黏膜內(nèi)各細胞間的平衡及通信對維持口腔黏膜微環(huán)境的穩(wěn)定及口腔黏膜疾病的發(fā)生發(fā)展極為重要,特定口腔黏膜位置單細胞水平的高通量測序能更進一步揭示其內(nèi)在聯(lián)系。

Zhao等[49]描繪了人正常口腔黏膜的單細胞圖譜,發(fā)現(xiàn)其中一半為免疫細胞,其次為基質(zhì)細胞(成纖維細胞和內(nèi)皮細胞)和上皮細胞,通過亞群分析發(fā)現(xiàn)T細胞構成免疫細胞的主要成分,其中主要是γδ T細胞,而巨噬細胞包括有兩種不同的激活狀態(tài)及靜息狀態(tài);此外,成纖維細胞作為主要的基質(zhì)細胞,其與其他細胞間的通信最為頻繁,這也進一步表明了上皮-基質(zhì)-免疫細胞間通信在維持黏膜內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要作用。而當牙周炎存在時,口腔黏膜(牙齦)出現(xiàn)炎癥表現(xiàn),Williams等[50]通過構建健康人和牙周炎患者口腔黏膜的單細胞圖譜(圖1),發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞在牙周炎中過度活化,進而招募免疫細胞尤其是中性粒細胞,從而促進炎癥發(fā)生,揭示了基質(zhì)細胞-免疫細胞軸在疾病發(fā)生發(fā)展中的重要作用。在機體疾病狀態(tài)下,細胞間的平衡同樣被打亂,Wang等[51]發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病(T2DM)的背景下,口腔黏膜的屏障功能發(fā)生障礙,上皮/基質(zhì)比率降低,成纖維細胞中的炎性因子增加。這種具有轉錄多樣性及與中性粒細胞、γδ T細胞等固有免疫細胞相互作用的成纖維細胞亞群被定義為“免疫樣”基質(zhì)細胞。這也從上皮-基質(zhì)-免疫軸的角度闡明T2DM與口腔黏膜疾病及牙周損害之間的潛在聯(lián)系。而在特定的口腔黏膜疾病中,也存在不同的免疫微生態(tài),Li等[52]發(fā)現(xiàn)口腔黏膜扁平苔蘚(oral lichen planus,OLP)組織中的免疫激活狀態(tài),主要表現(xiàn)為以Trm和Tem細胞為主的T細胞富集以及表現(xiàn)出的更高的細胞毒性,同時淋巴細胞遷移相關通路也被激活。成纖維細胞通過促進免疫細胞向結締組織外滲參與到免疫過程中,這為OLP的診斷及干預提供了新的見解。

A:口腔黏膜組織的示意圖,E:上皮,LP:固有層;B:通過單細胞測序鑒定的主要細胞類型的UMAP圖示(左)和按組織類型排列的相對細胞比例條形圖(右)。

為進一步揭示口腔黏膜疾病的發(fā)生發(fā)展機制,Caetano等[53]將單細胞測序與空間轉錄組技術結合(圖2),研究細胞間的空間交互作用,并且聯(lián)合高分辨率多重熒光雜交技術,發(fā)現(xiàn)了一群位于高度免疫原性區(qū)的成纖維細胞亞群,其通過CXCL8和CXCL10招募淋巴細胞,這也進一步表明了基質(zhì)細胞在局部免疫反應中的作用,揭示疾病狀態(tài)下口腔黏膜細胞的區(qū)域異質(zhì)性。

A:人類口腔黏膜的示意圖,顯示不同的上皮區(qū)域,口腔上皮(OE),口腔溝內(nèi)上皮(OSE)和連接上皮(JE);B:典型的口腔黏膜炎癥切面的H&E圖像,顯示了上皮和結締組織區(qū)域之間的界限;C:使用BayesSpace分析切片中人類口腔黏膜區(qū)域。

5 未來展望

單細胞測序技術使生命科學領域中各學科的研究取得巨大進步,通過單細胞水平的高通量測序分析能夠揭示新的細胞亞群、識別細胞分化軌跡、鑒別不同疾病背景下的細胞信號通路。單細胞測序技術目前已經(jīng)能夠檢測幾乎所有的組學,包括全基因組、代謝組、蛋白組等,多組學研究也更深入地揭示組織細胞基因表達。然而,在單細胞懸液制備過程中其組織空間信息也會丟失,空間位置信息也是決定細胞命運的重要因素。在2022年空間轉錄組學技術入選為Nature值得關注的七大技術之一,空間轉錄組技術與單細胞測序技術的聯(lián)合應用也逐漸受到關注。目前,單細胞測序與空間轉錄組的聯(lián)合已應用于研究不同領域的基因表達差異對疾病發(fā)生發(fā)展的影響,包括肝病的病理生理機制研究[54]、結直腸癌病理機制[55]、腸道發(fā)育[56]、心血管疾病發(fā)生發(fā)展等[57]。

在口腔醫(yī)學領域,單細胞測序技術的應用已日漸普遍,在口腔組織的發(fā)育與口腔疾病的發(fā)展研究中發(fā)揮了重要作用,但空間轉錄組技術相關的口腔研究仍在起步階段。通過聯(lián)合兩種技術,未來可用于構建口腔組織發(fā)育的動態(tài)表達圖譜與口腔疾病的分子差異表達的空間圖譜;探索口腔組織發(fā)生過程中細胞的形態(tài)學,分子特性的差異,以及在不同發(fā)育階段的空間分布及基因表達;研究牙周炎癥微環(huán)境下不同細胞之間的相互作用,探究炎癥區(qū)域與正常組織的細胞構成及基因表達特征;研究口腔癌的腫瘤內(nèi)空間分布異質(zhì)性,通過分析鄰近腫瘤區(qū)域的基因表達分布對腫瘤進行重新分層并識別診斷標志物等。

未來,隨著單細菌測序、石蠟組織切片空間轉錄組測序等技術的突破和測序分辨率的提高,探究組織、細胞和微生物的空間位置信息及不同空間位置的基因表達差異將成為研究的熱點,也將為臨床疾病的診斷治療帶來新的參考。