甘草甜素調節TGF-β/Smad信號通路對肺癌荷瘤小鼠放射性肺損傷的影響

黃如敬 魯洪嶺 吳超 楊洪娟 尹曉明 趙陽 孫云川

放射性肺損傷(radiation-induced lung injury,RILI)是由于放射治療時脫靶而產生的不良反應[1]。肺癌在放射治療時容易產生RILI,使正常肺組織損傷[2-3]。甘草甜素(glycyrrhizin,GL)主要存在于中藥甘草的根中,具有鎮靜、抗癌、抗炎、抗氧化等作用[4-5]。有研究稱GL可減輕小鼠輻射照射引起的RILI[6]。轉化生長因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)在癌癥中對于上皮間質轉化、腫瘤細胞轉移具有調節作用。TGF-β/Smad通路被發現在腎、肺纖維化中是重要的介導信號[7-8]。有研究顯示TGF-β/Smad通路對經過電離輻射的肺腺癌細胞具有一定影響,可促進肺腺癌細胞輻射誘導的上皮間質轉化,增加癌細胞侵襲和遷移[9]。然而,GL是否可以通過TGF-β/Smad通路對肺癌移植瘤小鼠的RILI產生影響還未有研究。本文旨在探討GL對肺癌移植瘤小鼠RILI的影響及作用機制。

資料與方法

一、材料

1.實驗動物

48只雄性、8周齡的C57BL/6J小鼠購自湖北貝恩特生物科技有限公司,生產許可證號SCXK(鄂)2021-0027。小鼠飼養在本院實驗動物中心,本研究已經獲得本院動物倫理委員會的批準(2021-0825)。

2.主要試劑

GL來自上海吉至生化科技有限公司;SRI-011381 TGF-β激動劑購自上海經科化學科技有限公司;小鼠白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒來自上海酶研生物科技有限公司;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒購自重慶蒙博生物科技有限公司;小鼠羥脯氨酸(hydroxyproline,HYP)檢測試劑盒來自上海聯邁生物工程有限公司;小鼠髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)檢測試劑盒購自南京博世鑫生物科技有限公司;兔源一抗TGF-β、α-SMA來自北京中山公司;TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7兔源一抗來自SantaCurs公司;GAPDH兔源一抗購自上海研卉生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自北京泰澤嘉業科技發展有限公司。

二、方法

1.肺癌荷瘤小鼠模型以及RILI模型的構建及分組

使用Lewis小鼠肺癌細胞,用C57BL/6J小鼠構建肺癌荷瘤小鼠模型[10]。將Lewis細胞經皮下注射入小鼠的右腋下靠近胸部的位置,建立Lewis肺癌荷瘤小鼠,當腫瘤達到5 mm3時,將肺癌荷瘤小鼠分組。

取12只未進行移植瘤的C57BL/6J小鼠作為NC組;隨機從肺癌荷瘤小鼠中分別取出12只作為照射+Model組、照射+GL組(10 mg/kg)[6]、照射+GL+SRI-011381組。照射+Model組小鼠全胸照射20Gy/天(RILI模型建立),然后注射與GL等量的生理鹽水;照射+GL組小鼠全胸照射20Gy/天,然后腹膜內注射10 mg/kg GL;照射+GL+SRI-011381組小鼠全胸照射20Gy/天,腹膜內注射10 mg/kg GL外,再腹腔注射30 mg/kg SRI-011381處理[11],NC組小鼠則腹膜注射等體積的生理鹽水,每天一次,連續干預28天。

2.ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平的變化

收集各組小鼠的主動脈血,然后離心,取血清備用。然后分別依據IL-6、TNF-α的ELISA試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平,并用多功能酶標儀檢測吸光度值計算IL-6、TNF-α的表達水平。

3.HE染色檢測小鼠肺組織病理變化

從各組隨機選取6只小鼠并從中收集肺組織,在4℃下固定在4%的多聚甲醛中,4 h后用PBS洗滌、乙醇脫水、然后包埋在石蠟中。將肺組織切片并染色。即使用蘇木精伊紅染色,然后處理并用光學顯微鏡進行肺組織的病理學觀察。

4.試劑盒檢測小鼠肺組織中HYP、MPO含量

將小鼠的肺組織取出并使用無菌剪刀剪碎、勻漿,然后離心并收集上清液備用。根據試劑盒廠商提供的說明方法,檢測肺組織上清液中HYP、MPO的含量。

5.免疫組織化學染色法(immunocytochemistry,IHC)檢測小鼠肺組織中TGF-β、α-SMA蛋白表達

根據免疫組織化學試劑盒的說明檢測蛋白表達。將各組小鼠肺組織切片,脫蠟水化,在檸檬酸緩沖液中修復15 min,加入過氧化氫反應10 min,洗滌、用山羊血清室溫下封閉,10 min后加入TGF-β、α-SMA抗體,在4℃下孵育過夜,再次洗滌、加入山羊抗兔二抗,孵育10 min,PBS洗滌后,用DAB顯色,然后脫水、封片后,采用光學顯微鏡觀察切片情況。

6.Western Blot檢測小鼠肺組織TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3、Smad7蛋白表達

取各組小鼠的肺組織,勻質并添加到RIPA裂解緩沖液中,提取總蛋白。測定肺組織蛋白濃度,通過SDS-PAGE凝膠電泳,然后轉移到PVDF膜中,封閉后,將膜與TGF-β1(1 ∶1000)、p-Smad2/3(1 ∶1000)、Smad2/3(1 ∶1000)、Smad7(1 ∶1000)、GAPDH(1 ∶1000)的一抗一起孵育,然后將其與HRP偶聯的二抗一起孵育。使用增強型化學發光檢測試劑盒使蛋白質可視化,使用Image J軟件定量分析蛋白表達。

三、統計學分析

結 果

一、各組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平比較

與NC組比較,照射+Model組IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05);與照射+Model組比較,照射+GL組IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05);與照射+GL組比較,照射+GL+SRI-011381組IL-6、TNF-α水平升高(P<0.05)(見表1)。

表1 各組小鼠血清中IL-6、TNF-α水平比較

二、各組小鼠肺組織病理損傷觀察

NC組小鼠肺組織中結構正常,肺泡間隔正常,而且肺泡腔擴張良好;與NC組比較,照射+Model組小鼠肺組織中肺泡間隔模糊,結構不明顯,而且肺泡未擴張,出現充血以及炎性細胞浸潤現象;與照射+Model組比較,照射+GL組小鼠肺組織中肺泡間隔逐漸清晰,肺泡恢復擴張能力,細胞充血減輕,炎性細胞浸潤減輕;與照射+GL組比較,照射+GL+ SRI-011381組小鼠肺部中肺泡間隔出現不明顯現象,且肺泡擴張減弱,充血與炎性細胞浸潤加重(見圖1)。

圖1 HE染色檢測小鼠肺組織病理變化(×200)

三、各組小鼠肺組織中HYP、MPO比較

與NC組比較,照射+Model組HYP、MPO水平升高(P<0.05);與照射+Model組比較,照射+GL組HYP、MPO水平降低(P<0.05);與照射+GL組比較,照射+GL+SRI-011381組HYP、MPO水平升高(P<0.05)(見表2)。

表2 各組小鼠肺組織中HYP、MPO比較

四、各組小鼠肺組織中TGF-β、α-SMA的表達

與NC組比較,照射+Model組TGF-β、α-SMA表達增加(P<0.05);與照射+Model組比較,照射+GL組TGF-β、α-SMA表達降低(P<0.05);與照射+GL組比較,照射+GL+SRI-011381組TGF-β、α-SMA表達升高(P<0.05)(見圖2和表3)。

圖2 TGF-β、α-SMA抗體染色的各組小鼠肺組織圖像(免疫組織化學,×200)

表3 各組小鼠肺組織中TGF-β、α-SMA表達比較

五、各組小鼠肺組織中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7相關蛋白表達比較

與NC組比較,照射+Model組TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達升高,Smad7蛋白表達降低(P<0.05);與照射+Model組比較,照射+GL組TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達降低,Smad7蛋白表達升高(P<0.05);與照射+GL組比較,照射+GL+SRI-011381組TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達升高,Smad7蛋白表達降低(P<0.05)(見圖3和表4)。

圖3 Western Blot檢測小鼠腦組織中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達注:A:NC組;B:照射+Model組;C:照射+GL組;D:照射+GL+ SRI-011381組

表4 各組小鼠腦組織中TGF-β1、p-Smad2/3、Smad7蛋白表達比較

討 論

人體內肺組織是對輻射較為敏感的組織之一,這就導致在肺癌放射治療中容易造成RILI,使肺組織纖維化、血管損傷、壞死等,進一步在臨床中發展為明顯的肺炎或肺纖維化[12-13]。為了增加肺癌患者的有效治療方法,減輕患者由于放療帶來的副作用,本研究用小鼠Lewis肺癌細胞進行造模,再將Lewis肺癌移植瘤小鼠采用射線照射制造RILI模型進行探究。結果顯示,與NC組比較,照射+Model組小鼠肺損傷嚴重,而且血清及肺組織中相關炎癥因子也發生變化。表明肺癌荷瘤小鼠在射線照射后肺部明顯出現損傷,形成RILI并影響體內各項機能。

GL是一種三萜糖苷,作為中藥用于抗炎、抗氧化、抗腫瘤和保肝。例如其可以減輕金黃色葡萄糖球菌引起的急性肺損傷,減輕炎癥;可以通過抑制相關通路從而減輕膿毒癥引起的急性呼吸窘迫綜合征[14-15]。另外有研究顯示GL能抑制TGF-β1/Smad1/2信號通路,進而抑制肺上皮細胞的上皮間質轉化,減輕肺組織的纖維化和炎癥作用[16]。GL在肺部的相關研究較多,但是對于GL在輻射引起的肺損傷中研究還較少。因此本研究繼續探索GL在輻射導致的肺部疾病中的作用,結果顯示當用GL干預RILI的肺癌荷瘤小鼠后,小鼠血清中的炎癥因子水平下降明顯,肺組織病理損傷好轉,肺組織中的HYP、MPO降低,都表明GL可以改善肺癌荷瘤小鼠放療引起的RILI,減輕炎癥反應。

TGF-β涉及許多細胞的活動調節,而且主要是通過Smad途徑進行調控使信號傳導,所以TGF-β/Smad信號通路就與細胞的生長與發展密切相關,例如腫瘤轉移、免疫調節以及癌癥的放射性耐藥,包括放射性肺纖維化[17-18]。報道稱,調節TGF-β/Smad信號通路可以減輕肺纖維化;而且通過化療藥物的調節,TGF-β/Smad信號通路中TGF-β1、Smad3下調,可以有效減輕RILI引起的炎癥反應以及肺纖維化[19-20]。本研究對TGF-β/Smad信號通路在肺癌移植瘤小鼠中因放療引發的RILI進行研究,并探究藥物GL對其的影響。結果顯示,照射后肺癌荷瘤小鼠肺組織中TGF-β、α-SMA表達明顯,TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達升高,Smad7蛋白表達減少;在GL治療后TGF-β、α-SMA表達降低,TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達降低,Smad7蛋白表達升高,猜測GL可能通過抑制TGF-β/Smad通路改善肺癌荷瘤小鼠RILI。為了驗證此猜測,利用TGF-β激活劑SRI-011381來干預照射+GL處理的肺癌荷瘤小鼠,顯示,SRI-011381減弱了GL對肺癌荷瘤小鼠RILI的減輕作用,表明GL可能通過抑制TGF-β/Smad信號通路減輕肺癌荷瘤小鼠的RILI。

綜上所述,GL可能通過調節TGF-β/Smad通路相關因子表達,抑制TGF-β/Smad信號通路而對肺癌荷瘤小鼠放療引發的RILI產生治療效果,所以本文為RILI的治療以及提高肺癌放療效果、減少副作用提供了新的方向。而對于GL對肺癌荷瘤小鼠RILI的影響,通過TGF-β/Smad信號通路發揮作用,還需要對其具體的藥理作用機制進行深入探究。