lncR FOXD2-AS1調控miR-145-5p對非小細胞肺癌細胞生物學特性的影響

王巍，王志武，于鎵銳，董量，曹博，李劍鋒

1 唐山市人民醫院放化二科，河北唐山 063000；2 唐山市人民醫院普外科；3 唐山市人民醫院胸外科

肺癌是全球常見的惡性腫瘤之一，是癌癥相關死亡的主要原因，約占癌癥死亡人數的25%［1］。非小細胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的80%~85%，總體五年生存率較低（10%~15%）［2］。長鏈非編碼RNA（lncR）是一類長度約200 nt的非編碼RNA。研究發現，lncR 能與miRNA 競爭性結合以減少miRNA 對其靶基因的調節，從而調控腫瘤的發生進展［3］。lncR-FOXD2-AS1是lncRNA 家族成員之一。研究表明，lncR-FOXD2-AS1 在多種惡性腫瘤表達上調，作為致癌因子發揮作用［4］。至今，lncR-FOXD2-AS1 在NSCLC 中的研究較少，且作用機制尚不明確。近期研究發現，miR-145-5p 可能作為lncR-FOXD2-AS1的靶基因發揮腫瘤調控作用［5］。miR-145-5p 是目前研究較多的腫瘤相關miRNA 之一，其在NSCLC組織和細胞中異常低表達，而miR-145-5p 的過表達能抑制NSCLC 細胞增殖、遷移、侵襲及上皮-間質轉化（EMT）過程，且增強對化療藥物的敏感性［6-9］。目前lncR-FOXD2-AS1 能否靶向miR-145-5p 從而影響NSCLC 細胞的生物學行為尚不清楚。2022 年11月—2023年4月，我們探討了lncR-FOXD2-AS1調控miR-145-5p 對NSCLC 細胞增殖、遷移、侵襲和EMT等生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人非小細胞肺癌系A549、H1299、SK-MES-1 及人正常肺支氣管上皮細胞系16HBE 購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；TRIzol試劑、BCA蛋白定量試劑盒購自北京索寶來科技有限公司；Lipofectamine 2000 購自美國Invitrogen公司；lncR-FOXD2-AS1小干擾RNA（si-FOXD2-AS1）及其陰性對照（si-NC）、miR-145-5p模擬物（miR-145-5p mimics）及其陰性對照（miR-NC）、熒光素酶報告基因質粒野生型（WT-FOXD2-AS1）及突變型（MUTFOXD2-AS1）購自上海吉瑪制藥技術有限公司；PrimeScript RT 試劑盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；CCK8增殖檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Transwell小室購自購自美國Millipore 公司；Matrigel 膠購自美國BD 公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega 公司；N-cadherin、E-cadherin、Fibronectin、GAPDH一抗抗體及二抗IgG抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞培養、轉染及分組 人肺腺癌細胞系A549、H1299、人肺鱗癌細胞系SK-MES-1及人正常肺支氣管上皮細胞系16HBE購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，均置于RPMI1640培養基（含10%胎牛血清）中培養，顯微鏡下觀察細胞生長狀態，細胞融合度達80%～90%時進行細胞傳代培養。轉染操作時，取SK-MES-1 細胞接種于6 孔細胞板，根據轉染載體不同，將細胞分為NC 組和si-FOXD2-AS1組，應用Lipofectamine 2000 分別將si-NC 和si-FOXD2-AS1轉染至各組細胞，轉染后6 h更換培養基，轉染后48 h收集細胞，RT-qPCR 檢測lncR-FOXD2-AS1 表達驗證轉染效率。

1.3 細胞lncR-FOXD2-AS1 和miR-145-5p 表達檢測 采用RT-qPCR 法。TRIzol 試劑提取A549、H1299、SK-MES-1、16HBE 細胞總RNA，應用Prime-Script RT 試劑盒反轉錄合成cDNA。取2 μL cDNA作為模板，按照SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說明書操作加入PCR引物進行PCR擴增反應。PCR引物序列：lncR-FOXD2-AS1 正向引物：5'-TGGACCTAGCTGCAGCTCCA-3'，反向引物：5'-AGTTGAAGGTGCACACACTG-3'；miR-145-5p 正向引物：5'-CCTTGTCCTCACGGTCCAGT-3'，反向引物：5'-AACCATGACCTCAAGAACAGTATTT-3'；GAPDH 正向引物：5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3'，反向引物：5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'；U6 正向引物：5'-AACGAGACGACGACAGAC-3'，反向引物：5'-GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3'。PCR 反應條件：95 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共50個循環。GAPDH作為lncR-FOXD2-AS1的內參基因，U6 作為miR-145-5p 的內參基因，以2-ΔΔCt法計算lncR-FOXD2-AS1和miR-145-5p表達。

1.4 增殖活性 采用CCK-8 法。收集轉染后48 h的兩組SK-MES-1 細胞，重懸制備單細胞懸液，以3 000 個/孔接種于96 孔細胞板中，在37 ℃、5%CO2環境下繼續孵育0、24、48 h 時，向各孔加入10 μL CCK-8 溶液，同樣條件下繼續培養2 h 后，酶標儀測定450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.5 細胞遷移、侵襲能力檢測 遷移能力檢測采用Transwell 遷移實驗：收集轉染后48 h 的兩組SK-MES-1 細胞制備無血清單細胞懸液，取200 μL細胞濃度為1×105/mL 的細胞懸液接種于Transwell小室上室，取含20%胎牛血清的細胞培養基500 μL加入Transwell 小室下室，細胞在37 ℃、5%CO2環境下繼續培養24 h；取出小室，去除上室面表面未穿膜的細胞，PBS 漂洗3 次，4% 多聚甲醛固定細胞15 min，PBS 漂洗3次后染色。顯微鏡下計數穿膜細胞數目。侵襲能力檢測采用Transwell 侵襲實驗：實驗前首先用0.5 mg/mL 基質膠預鋪Transwell 小室上室面，其余步驟與遷移實驗相同。

1.6 E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin 蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。收集轉染后48 h 的兩組SK-MES-1 細胞，裂解液提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白質濃度。應用SDS-PAGE凝膠電泳分離等量蛋白質，將蛋白條帶轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。將PVDF 膜與一抗N-cadherin（稀釋比1∶500）、E-cadherin（稀釋比1∶1 000）、Fibronectin（稀釋比1∶500）、GAPDH（稀釋比1∶1 000）抗體在4 ℃條件下孵育過夜，洗膜后加入二抗（稀釋比1∶5 000），室溫孵育1 h后，化學發光試劑暗室內顯影，Quantity one軟件分析各條帶的灰度值。

1.7 lncR-FOXD2-AS1與miR-145-5p靶向調控關系驗證 采用雙熒光素酶報告基因實驗。收集對數生長期的SK-MES-1 細胞接種于24 孔細胞板，應用Lipofectamine 2000 分 別 將 WT-FOXD2-AS1 或MUT-FOXD2-AS1 與miR-145-5p mimics 或miR-NC共轉染至細胞，根據轉染載體不同，轉染后細胞分為四組：WT-FOXD2-AS1+miR-145-5p mimics 組、WT-FOXD2-AS1+miR-NC 組 、MUT-FOXD2-AS1+miR-145-5p mimics 組、MUT-FOXD2-AS1+ miR-NC組，轉染后48 h，根據雙熒光素酶報告基因試劑盒說明書檢測相對熒光素酶活性。

1.8 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。符合正態分布的計量數據以±s表示，兩組間數據的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC 細胞系lncR-FOXD2-AS1、miR-145-5p表達比較 A549、H1299、SK-MES-1、16HBE 細胞中lncR-FOXD2-AS1 相對表達量分別為1.74 ± 0.16、1.69 ± 0.19、1.97 ± 0.20、1.00 ± 0.03，miR-145-5p相對表達量分別為0.52 ± 0.10、0.56 ± 0.13、0.44 ±0.12、0.99 ± 0.02。A549、H1299、SK-MES-1 細胞系中lncR-FOXD2-AS1 表達高于16HBE（t分別為7.874、6.213、8.308，P均＜0.05），miR-145-5p 表達低于16HBE（t分別為7.983、5.663、7.831，P均＜0.05）。 選取lncR-FOXD2-AS1 相對高表達的SK-MES-1作為敲低實驗的研究對象。

2.2 轉染si-FOXD2-AS1 后SK-MES-1 細胞中lncR-FOXD2-AS1 和miR-145-5p 表達比較 NC 組和si-FOXD2-AS1 組細胞中lncR-FOXD2-AS1 相對表達量分別為1.02 ± 0.03、0.35 ± 0.07，miR-145-5p相對表達量分別為1.01 ± 0.02、1.99 ± 0.11。si-FOXD2-AS1組細胞中lncR-FOXD2-AS1的表達低于NC組（P＜0.05），miR-145-5p表達高于NC組（P＜0.05）。

2.3 兩組不同時點SK-MES-1 細胞增殖活性比較兩組細胞不同時點的OD值結果見表1，si-FOXD2-AS1組SK-MES-1 細胞0、24、48 h 時的OD 值均低于NC組（P均＜0.05）。

表1 兩組不同時點SK-MES-1細胞OD值比較（± s± s）

表1 兩組不同時點SK-MES-1細胞OD值比較（± s± s）

組別OD值si-FOXD2-AS1組NC組t P 0 h 0.50 ± 0.12 0.89 ± 0.10 4.324＜0.05 24 h 0.99 ± 0.08 2.09 ± 0.21 8.478＜0.05 48 h 1.80 ± 0.17 3.76 ± 0.28 10.364＜0.05

表2 兩組SK-MES-1細胞EMT相關蛋白表達比較（± s± s）

表2 兩組SK-MES-1細胞EMT相關蛋白表達比較（± s± s）

組 別si-FOXD2-AS1組NC組t P E-cadherin 1.10 ± 0.08 0.42 ± 0.09 9.781＜0.05 N-cadherin 0.40 ± 0.07 1.38 ± 0.12 12.218＜0.05 Fibronectin 0.55 ± 0.06 1.63 ± 0.11 14.929＜0.05

2.4 兩組SK-MES-1 細胞遷移、侵襲能力比較 NC組、si-FOXD2-AS1組SK-MES-1細胞遷移穿膜細胞數分別為（156 ± 23）、（81 ± 16）個，侵襲穿膜細胞數分別為（137 ± 25）、（72 ± 13）個，si-FOXD2-AS1組SK-MES-1細胞遷移、侵襲穿膜細胞數低于NC組（P均＜0.05）。

2.5 兩組SK-MES-1細胞EMT相關蛋白表達比較si-FOXD2-AS1 組SK-MES-1 細胞中E-cadherin 蛋白表達高于NC 組（P＜0.05），N-cadherin、Fibronectin 蛋白表達低于NC組（P均＜0.05）。

2.6 lncR-FOXD2-AS1對miR-145-5p靶向調控的關系 生物信息學網站Starbase 3.0 （http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）和Targetscan （http：//www.targetscan. org/vert_72/） 均顯示lncR-FOXD2-AS1與 miR-145-5p存在結合位點（圖1）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，WT-FOXD2-AS1+miR-145-5p mimics 組SK-MES-1 細胞的相對熒光素酶活性明顯低于WT-FOXD2-AS1+miR-NC 組（0.38 ± 0.09 vs 0.99 ± 0.02，P＜0.05），而MUT-FOXD2-AS1+miR-145-5p mimics 組、MUT-FOXD2-AS1+miR-NC 組SKMES-1 細胞的相對熒光素酶活性比較，差異無統計學意義（1.01 ± 0.01 vs 1.02 ± 0.03，P>0.05）。

圖1 lncR-FOXD2-AS1與 miR-145-5p結合位點

3 討論

近年來，lncRNA的突變和表達異常與NSCLC發生進展的關系受到較大關注。研究報道lncR-LHFPL3-AS2 通過與SFPQ 相互作用共同調節TXNIP表達，對NSCLC的轉移起抑制作用［7］。lncR-BZRAP1-AS1被發現與NSCLC 的惡性程度和預后有關［8］。WANG 等［9］報道lncR-LSOX21-AS1通過調控miR-24-3p/PIM2軸調控肺癌的進展。但目前尚未發現在NSCLC發生轉移中起關鍵調控作用的lncR［10］。lncR-FOXD2-AS1是近幾年被報道的腫瘤相關性lncR 成員之一，目前在肝細胞癌［11］、結腸癌［12］、食管癌［13］、惡性膠質瘤［14］等腫瘤組織或細胞中發現lncR-FOXD2-AS1表達異常，且與患者預后及藥物抵抗有關。本研究通過RT-qPCR發現，人NSCLC 細胞系A549、H1299、SK-MES-1 中lncR-FOXD2-AS1的表達水平明顯高于人正常肺支氣管上皮細胞系16HBE，提示lncR-FOXD2-AS1 在NSCLC 發生發展中可能起癌基因作用。進一步研究發現，敲低lncR-FOXD2-AS1 可顯著抑制細胞增殖活性、遷移和侵襲能力，抑制細胞的EMT 過程，證明lncR-FOXD2-AS1 在NSCLC 發生發展中起癌基因作用，敲低lncR-FOXD2-AS1 可以抑制NSCLC 的發生發展。

研究顯示，lncR具有內源性競爭性RNA（ceRNA）的功能，其能與miRNA競爭性結合，與miRNA產生相互作用從而影響miRNA功能，產生對細胞功能的調控作用［14］。生物信息學網站Starbase 3.0 和Targetscan均顯示lncR-FOXD2-AS1 與 miR-145-5p 存在結合位點，本研究通過雙熒光素酶報告基因結果證實lncR-FOXD2-AS1 能直接靶向調控miR-145-5p 從而影響細胞的熒光素酶活性。并且敲低實驗結果顯示敲低lncR-FOXD2-AS1 表達的SK-MES-1 細胞的miR-145-5p水平明顯增高，說明敲低lncR-FOXD2-AS1對NSCLC細胞增殖活性、遷移和侵襲及EMT過程的抑制作用，可能是通過靶向miR-145-5p基因實現的。

綜上所述，lncR-FOXD2-AS1在NSCLC中表達升高。敲低lncR-FOXD2-AS1通過靶向調控miR-145-5p抑制NSCLC細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT進程。