當(dāng)歸芍藥散含藥血清及其有效成分對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠的作用及機(jī)制

劉化君，張挺

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203

慢性腎臟疾病（CKD）在全球的患病率為10%～15%［1-2］，長期的腎臟炎癥損傷多會(huì)導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化（RIF）的發(fā)生。RIF 是腎小管上皮細(xì)胞（RTECs）和腎小管周圍毛細(xì)血管之間細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過度沉積，導(dǎo)致間質(zhì)結(jié)締組織與膠原纖維增多并伴隨實(shí)質(zhì)細(xì)胞減少的一種病理現(xiàn)象［3］，被認(rèn)為是終末期腎病階段的共同途徑，是CKD 的主要病理過程之一。當(dāng)歸芍藥散（DSS）用于糖尿病腎病、腎病綜合征等取得較好療效［4］，其活血利水作用可有效抑制腎臟慢性炎癥損傷，緩解RIF，改善腎功能［5］。NLRP3 炎癥小體在誘導(dǎo)腎臟炎癥和纖維化中起重要作用，靶向抑制NLRP3 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白已成為治療CKD 的潛在方向［6］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程作為RIF的重要影響因素［7］，影響RTECs黏附蛋白的表型改變及間質(zhì)纖連蛋白（FN）的表達(dá)，是近年RIF 潛在治療機(jī)制的研究熱點(diǎn)。2020 年9 月—2022 年12 月，本研究利用TGF-β 誘導(dǎo)NRK-52E大鼠腎小管上皮細(xì)胞株腎間質(zhì)纖維化模型，驗(yàn)證主要效應(yīng)成分阿魏酸（FA）、芍藥苷（PF）與當(dāng)歸芍藥散含藥血清（DSSS）對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性Sprague Dawley 大鼠16 只，購買、飼養(yǎng)均于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理研究委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理學(xué)批準(zhǔn)號(hào)PZSHUTCM211115022）。大鼠腎小管上皮細(xì)胞株（NRK-52E 細(xì)胞），購自上海酶研生物科技有限公司（ATCC 來源）。其他試劑及儀器：胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），100 U/L青鏈霉素、DMEM-F12培養(yǎng)液（Corning公司），胰蛋白酶-EDTA 溶液（Sigma-Aldrich 公司），BCA 蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司），TGF-β1（Peprotech公司），GMTrans脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑（上海吉滿生物科技有限公司），PF（美國MedChemexpress生物科技有限公司），F(xiàn)A（德國Merck公司），酶標(biāo)儀（美國Bio-TEK，型號(hào)：ELX-800），電泳儀及配套電泳槽（美國Bio-Rad 公司，PowerPac 系列），化學(xué)發(fā)光成像分析儀（美國 Protein Simple 公司），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱Model370 series（美國Thermo 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DSS藥液制備 DSS方劑組成為當(dāng)歸9 g、白芍18 g、茯苓12 g、白術(shù)12 g、澤瀉12 g、川芎9 g，均由上海康橋中藥飲片有限公司提供。將以上中藥清洗后置于去離子水中浸泡0.5 h，使用煎藥鍋熬煮2 h，得到水煎液1.5 L，后濃縮得到0.756 g/mL濃度的DSS藥液；常溫3 000 r/min離心后取上清液，過濾除菌后-20 ℃冷藏備用。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理 16 只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組4 只。分組標(biāo)記后適應(yīng)性飼養(yǎng)，正常飲食，12 h/12 h 晝夜光照時(shí)間，待每組大鼠平均體質(zhì)量達(dá)到180 g即可開始灌胃。灌胃前觀察動(dòng)物一般狀態(tài)、活動(dòng)程度、排便情況。空白對(duì)照組（0.1 mL生理鹽水/10 g體質(zhì)量）、低劑量組（0.05 mL DSS藥液/10 g體質(zhì)量）、中劑量組（0.1 mL DSS 藥液/10 g 體質(zhì)量）、高劑量組（0.2 mL DSS 藥液/10 g 體質(zhì)量）每日同一時(shí)間進(jìn)行灌胃，持續(xù)7 d。

1.2.3 含藥血清制備 灌胃第7 日，按照原劑量分組標(biāo)準(zhǔn)灌胃40 min后進(jìn)行大鼠腹腔注射麻醉行腹主動(dòng)脈取血術(shù)。每只大鼠可取3～5 mL 血液，取得血樣置于離心管中室溫靜置2 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取血清并置于-4 ℃保存。待所有大鼠血樣完成離心，按照劑量分組將同組血清混合，獲得低、中、高劑量DSSS。置于56 ℃水浴30 min 后-80 ℃環(huán)境下冷藏。

1.2.4 腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將NRK-52E細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100 U/L青鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基）中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待對(duì)數(shù)生長期時(shí)用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以2×105/孔及2×104/孔密度接種于6孔板和96 孔板中，設(shè)置對(duì)照組（Control）、模型組（TGF-β 處理）、siRNA 轉(zhuǎn)染組（TGF-β+siRNA 處理）、FA 組（TGF-β+FA 處理）、PF 組（TGF-β+PF 處理）及DSSS 低、中、高劑量組（TGF-β+DSSS-L、TGF-β+DSSS-M、TGF-β+DSSS-H 分別處理）。siRNA 轉(zhuǎn)染組以NLRP3 siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)染6 h 后，給予4 ng/mL誘導(dǎo)纖維化48 h。siRNA 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得NLRP3 基因序列，選擇siRNA 靶位點(diǎn)后分析序列同源性，避免與其他編碼序列/EST 同源序列。使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選擇合適目標(biāo)序列，委托吉滿生物科技（上海）有限公司化學(xué)合成siRNA，正向引物：5'-GAACUCUUGACCAUUGGCAtt-3'，反向引物：3'-UGCCAAUGGUCAAGAGUUCtt-5'。

1.2.5 DSSS、FA、PF、TGF-β1對(duì)NRK-52E 細(xì)胞干預(yù)濃度選擇 待96 孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)24 h 貼壁后，棄舊培基，加入不同濃度DSSS、FA、PF、TGF-β 的DMEM 培養(yǎng)基。DSSS 濃度梯度：0、2%、4%、6%、8%、10%、12%，F(xiàn)A 濃度梯度：0、50、100、150、200、300、400 μmol/mL，PF 濃度梯度：0、50、100、150、200、300、400 μmol/mL，TGF-β 濃度梯度：0、1.25、2.5、3.75、5、7.5、10 ng/mL；每個(gè)濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h。在檢測時(shí)間點(diǎn)取出96 孔板，避光下加入CCK-8 溶液（每孔10 μL），放入培養(yǎng)箱90 min 后，使用酶標(biāo)儀測定每孔OD 值（波長450 nm），計(jì)算每組細(xì)胞的存活率及IC50值，確定DSSS、FA、PF、TGF-β對(duì)NRK-52E細(xì)胞的干預(yù)濃度。

1.2.6 DSSS、FA、PF 對(duì)各組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白及黏附蛋白作用檢測 采用以上實(shí)驗(yàn)確定的DSSS、FA、PF 濃度對(duì)NRK-52E 細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，取細(xì)胞裂解離心后上清液進(jìn)行BCA蛋白定量。使用RIPA、SDSloadingbuffer 配平后，經(jīng)常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，將膜置于相應(yīng)的一抗稀釋液中，4 ℃孵育12 h，多次洗滌后置于相應(yīng)的二抗稀釋液中，室溫孵育2 h。加入ECL 檢測試劑，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像檢測，ImageJ V1.8.0 軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)分析。以GAPDH 為內(nèi)參，比較各組間細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-18 的表達(dá)差異；以β-actin 為內(nèi)參，比較各組間黏附蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin的表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism8.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊時(shí)用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用Tamhanes's T2法并行Tukey 事后檢驗(yàn)；重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DSSS、FA、PF、TGF-β 對(duì)NRK-52E 細(xì)胞的干預(yù)濃度 不同成分干預(yù)NRK-52E 細(xì)胞48 h 后，酶標(biāo)儀于450 nm 波長處測量OD 值，計(jì)算所得IC50值。DSSS 在血清濃度小于5%時(shí)對(duì)細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，占比為5%時(shí)其對(duì)于NRK-52E 細(xì)胞的生存率影響最小，故DSSS 治療組分別以5%濃度低、中、高劑量DSSS 進(jìn)行干預(yù)，見圖1A。誘導(dǎo)纖維化模型細(xì)胞所用TGF-β濃度越高，細(xì)胞存活率越低，其IC50在7.352 ng/mL，故模型組給予完全培養(yǎng)基稀釋至4 ng/mL 的TGF-β 溶液誘導(dǎo)纖維化模型，見圖1B。PF 的IC50在350.9 μmol/mL，故篩選200 μmol/mL濃度作為可行的干預(yù)濃度，見圖1C。FA 的IC50為222.8 μmol/mL，故篩選75 μmol/mL 為可行的干預(yù)濃度，見圖1D。

圖1 不同濃度DSSS、TGF-β、PF、FA對(duì)NRK-52E細(xì)胞存活率的影響

2.2 各組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD、CASP-1、IL-18 表達(dá) 使用TGF-β 刺激后，模型組中NLRP3、GSDMD、Caspase-1、IL-18 表達(dá)增加，siRNA轉(zhuǎn)染后可抑制NLRP3 表達(dá)，并降低CASP-1、GSDMD、IL-18 表達(dá)。相較于模型組，DSSS 各劑量組、FA 組、PF 組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、GSDMD、CASP-1、IL-18表達(dá)比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組siRNA轉(zhuǎn)染組FA組PF組DSS低劑量組DSS中劑量組DSS高劑量組IL-18 0.210 ± 0.010 1.117 ± 0.090#0.217 ± 0.017*0.767 ± 0.084*0.294 ± 0.035*0.704 ± 0.079*0.536 ± 0.051*0.321 ± 0.062*NLRP3 0.165 ± 0.012 0.794 ± 0.052#0.171 ± 0.011*0.370 ± 0.043*0.183 ± 0.013*0.424 ± 0.070*0.391 ± 0.005*0.153 ± 0.009*GSDMD 0.232 ± 0.024 0.540 ± 0.047#0.111 ± 0.011*0.412 ± 0.081*0.091 ± 0.017*0.170 ± 0.010*0.389 ± 0.059*0.252 ± 0.038*CASP-1 0.159 ± 0.006 1.020 ± 0.029#0.164 ± 0.020*0.541 ± 0.040*0.211 ± 0.014*0.590 ± 0.094*0.276 ± 0.026*0.301 ± 0.045*

2.3 各組細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin 表達(dá) 使用TGF-β 刺激后，細(xì)胞FN 蛋白表達(dá)增加，E-Cadherin 表達(dá)下降，N-Cadherin 表達(dá)上升，E-Cadherin 與N-Cadherin 表達(dá)比值下降。DSSS中、高劑量可降低FN 蛋白表達(dá)；DSSS 各種劑量可抑制N-Cadherin 表達(dá)，并降低E-Cadherin/N-Cadherin比值；FA、PF 均能改善纖維化相關(guān)黏附蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin 表達(dá)情況；相較于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 各組細(xì)胞纖維化相關(guān)蛋白FN、E-Cadherin、N-Cadherin表達(dá)比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

組別對(duì)照組模型組siRNA轉(zhuǎn)染組FA組PF組DSS低劑量組DSS中劑量組DSS高劑量組E-Cadherin/N-Cadherin 2.606 ± 0.107 0.733 ± 0.015#1.234 ± 0.026*1.013 ± 0.032*2.322 ± 0.095*1.548 ± 0.035*1.831 ± 0.059*2.444 ± 0.157*FN 0.730 ± 0.079 1.436 ± 0.052#0.464 ± 0.037*1.193 ± 0.070*1.018 ± 0.020*1.388 ± 0.036 0.858 ± 0.037*0.640 ± 0.033*E-Cadherin 1.330 ± 0.046 0.922 ± 0.008#1.178 ± 0.014*1.141 ± 0.119*1.354 ± 0.037*1.016 ± 0.017 0.829 ± 0.029 1.064 ± 0.039 N-Cadherin 0.511 ± 0.031 1.258 ± 0.025#0.955 ± 0.023*1.124 ± 0.081*0.584 ± 0.028*0.656 ± 0.009*0.453 ± 0.001*0.436 ± 0.012*

3 討論

RTF 是CKD 的主要病理癥狀之一，其纖維化過程的關(guān)鍵步驟包括：①腎臟損傷引發(fā)的炎癥激活和免疫細(xì)胞浸潤；②生長因子、趨化因子和細(xì)胞因子等促纖維化介質(zhì)的釋放；③細(xì)胞外基質(zhì)合成/降解的不平衡，肌成纖維細(xì)胞的激活和ECM 在腎小管間質(zhì)的過度積聚；④EMT 和實(shí)質(zhì)細(xì)胞的不可逆轉(zhuǎn)的損失；⑤腎臟微血管的減少［8］。RETCs 廣泛參與RIF 過程，RETCs 的氧化損傷、炎癥募集、黏附蛋白表達(dá)、EMT等過程促使RIF進(jìn)展［9-11］。

細(xì)胞焦亡是一種高度促炎性的細(xì)胞程序性死亡方式，其促炎性來自于裂解性細(xì)胞死亡釋放炎癥因子IL-18、IL-1β，經(jīng)典通路中NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)CASP-1、GSDMD蛋白的活化、成熟［12］，最終由GSDMD在細(xì)胞膜上形成寡聚孔道，使細(xì)胞腫脹破裂，釋放被CASP-1 剪切成熟的促炎物質(zhì)IL-18、IL-1β 等，放大腎臟炎癥，在RIF 炎癥過程中起重要作用。故使用藥物對(duì)NLRP3、CASP-1、GSDMD 進(jìn)行抑制，可影響細(xì)胞焦亡的激活、炎癥蛋白的剪切與活化、穿孔素導(dǎo)致的細(xì)胞死亡及促炎作用，從而干擾細(xì)胞焦亡進(jìn)程，減輕腎臟炎癥及纖維化進(jìn)程［13］。

本研究用于制作纖維化模型NRK-52E 細(xì)胞的TGF-β分子，是纖維化過程的主要效應(yīng)子［14］。TGF-β結(jié)合于RETCs 表面受體，并發(fā)起下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促使RETCs 改變?cè)鰪?qiáng)EMT 過程，加速ECM 的產(chǎn)生和堆積；能激活MAPK、TNF、NF-κB等蛋白促進(jìn)炎癥表達(dá)［15］，激活細(xì)胞焦亡通路。在RIF 過程中EMT 不可忽視，RETCs 表面黏附蛋白的表達(dá)變化，如E-Cadherin 蛋白的降低和N-Cadherin 蛋白的增加［16］，被認(rèn)為是EMT 進(jìn)展的常見情況。隨著EMT 過程和炎癥信號(hào)的增強(qiáng)，免疫細(xì)胞募集浸潤、RETCs 穩(wěn)態(tài)丟失、黏附蛋白表型改變、亞穩(wěn)態(tài)間充質(zhì)細(xì)胞增加、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白沉積等因素綜合后，則在腎間質(zhì)形成慢性炎癥和纖維化環(huán)境［17］。

在體外實(shí)驗(yàn)中，使用4 ng/mL濃度的TGF-β可增強(qiáng)NRK-52E 細(xì)胞焦亡核心分子NLRP3、Caspase-1、GSDMD 蛋白與炎性因子IL-18 表達(dá)，提示激活了NLRP3 炎癥小體的組裝和促炎因子的釋放；細(xì)胞表層E-cadherin 表達(dá)減少，F(xiàn)N 和N-cadherin 表達(dá)增加，提示ECM中FN的數(shù)量增加，間質(zhì)纖維化進(jìn)展并伴隨EMT過程的發(fā)生。在使用NLRP3 siRNA脂質(zhì)粒復(fù)合體轉(zhuǎn)染沉默NLRP3 蛋白合成后，可觀察到焦亡通路受抑制對(duì)RETCs黏附蛋白表型的保護(hù)作用。纖維化標(biāo)志物FN 的表達(dá)降低及E-Cadherin/N-Cadherin 的增大，提示EMT 與RIF 進(jìn)展被抑制。研究表明，NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡被抑制，RIF 被緩解［18］，均佐證NLRP3 炎癥小體介導(dǎo)的經(jīng)典途徑焦亡與RIF、EMT過程有較強(qiáng)的相關(guān)性。

綜上所述，DSSS及其有效成分中的FA、PF均能明顯抑制TGF-β 誘導(dǎo)的NRK-52E 細(xì)胞纖維化模型中焦亡相關(guān)蛋白及纖維化蛋白表達(dá)，緩解RIF 及RETCs的EMT的發(fā)生發(fā)展。