基于Notch信號通路探討芪蛭皺肺顆粒對慢性阻塞性肺疾病大鼠Th1/Th2免疫平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制＊

馬若飛，蘇 苗，李金田，2＊＊，李 娟，張 毅，徐韋瑋，姜佳辰

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院 蘭州 730101；2.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室 蘭州 730000；3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 蘭州 730101）

慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive Pulmonary disease，COPD），是一種常見的慢性氣道疾病，其特征是持續(xù)存在的氣流受限及相應(yīng)的呼吸系統(tǒng)癥狀[1]。COPD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，其中炎癥反應(yīng)是COPD 的重要發(fā)病機(jī)制，免疫失衡可導(dǎo)致慢性炎癥持續(xù)加重，肺部及氣道的炎癥反應(yīng)和機(jī)體免疫功能失衡是COPD 患者肺組織損傷甚至死亡的主要原因[2]。輔助性T 細(xì)胞1（helper T cells 1，Th1）和輔助性T 細(xì)胞2（helper T cells 2，Th2）失衡引起的促炎/抗炎因子失衡是COPD 重要發(fā)病機(jī)制之一，在免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮了重要作用[3]。TNF-α 是COPD 發(fā)病過程中重要的炎癥和免疫調(diào)節(jié)因子[4]。果蠅雙翅邊緣缺刻同源基因（Notch）通路的受體Notch1/2/3/4 與配體Delta1/3/4、Jagged1/2 均為表達(dá)于細(xì)胞表面的單跨膜蛋白，受體配體結(jié)合后引起信號活化，下游靶基因Hes 和Hey 家族被激活，從而影響T 淋巴細(xì)胞的分化、增殖、凋亡[5]。Notch 通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及免疫失衡與COPD 肺組織及氣道炎癥損傷關(guān)系密切[6]。因此，Notch 信號通路介導(dǎo)的Th1/Th2 細(xì)胞失衡是COPD 發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制。

目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療COPD 的常規(guī)方法包括支氣管舒張劑、糖皮質(zhì)激素等藥物治療及呼吸支持等非藥物治療[1]，常伴有不良反應(yīng)及并發(fā)癥，且經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重，亟需探索更為安全有效的治療方法。芪蛭皺肺顆粒由導(dǎo)師李金田教授基于多年臨床經(jīng)驗及COPD 本虛標(biāo)實的病機(jī)特點研治而成，諸藥共奏益氣活血祛痰、理肺除脹平喘之功。課題組前期基礎(chǔ)研究證實，芪蛭皺肺顆粒具有緩解氣道炎癥、增強免疫功能、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)等作用[7-9]；臨床研究表明，芪蛭皺肺顆粒聯(lián)合西醫(yī)常規(guī)治療可有效改善AECOPD 患者痰瘀阻肺證癥狀[10]。

Th1、Th2、輔助性T 細(xì)胞17（Helper T cells 17，Th17）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Regulatory T cells，Treg）均由CD4+T 細(xì)胞分化而來，Notch 信號通路可通過調(diào)控CD4+T 細(xì)胞的分化水平從而影響Th 細(xì)胞比例平衡[11]。部分研究表明通過調(diào)節(jié)Notch 信號通路從而調(diào)控Th17/Treg 平衡可能是防治COPD 的有效方法[12-13]，但少有研究從調(diào)節(jié)Notch 信號通路進(jìn)而調(diào)控Th1/Th2 平衡的角度介入治療COPD。基于此，本研究通過建立COPD 大鼠模型，進(jìn)一步闡明Notch 信號通路與Th1/Th2 免疫平衡間的關(guān)系，以及研究芪蛭皺肺顆粒調(diào)控Th1/Th2 免疫平衡是否與Notch 信號通路相關(guān)，進(jìn)一步明確芪蛭皺肺顆粒治療COPD的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動物

SPF 級Wistar 大鼠70 只，雄性，體質(zhì)量200±20 g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級動物房，環(huán)境溫度（24±1）℃，濕度55%±5%。動物質(zhì)量證書許可證編號：SYXK（甘）2020-0001，動物設(shè)施使用證編號：SYXK（甘）2020-0009。

1.2 藥物

芪蛭皺肺顆粒（生產(chǎn)批號：170501）：由黃芪、水蛭、黨參、丹參、麥冬等組成，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥制備室生產(chǎn)，1 g芪蛭皺肺顆粒相當(dāng)于原生藥材6 g。醋酸地塞米松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，藥品準(zhǔn)字號：H33020822）：0.75 mg/片。蘭州香煙（甘肅煙草工業(yè)有限責(zé)任公司）：焦油量14 mg，煙氣煙堿量1.1 mg，煙氣一氧化碳量14 mg。

1.3 試劑

脂多糖（LPS）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio，貨號分別為707F031、20210310、20211118）；Alexa Fluor?647 anti-rat IFN-γAntibody、PE anti-rat IL-4 Antibody（Biolegend，貨號分別為 B311332、B332500）；Anti-Notch1 antibody（Abcam，貨號ab167441）；Hes1 antibody（GeneTex，貨號No.GTX108356）；Hey1 Rabbit Polyclonal antibody（Proteintech Group，Inc，貨號19929-1-AP）；Anti-β-actin，Goat Anti-Rabbit、Goat Anti-Mouse（Immunoway Biotechnology，貨號分別為YM3028、RS0002、RS0001）；Rat TNF-α ELISA KIT（武漢北鹿森生物科技有限公司，貨號0153320221011）；檸檬酸（pH=6.0）抗原修復(fù)液、EDTA 抗原修復(fù)液（pH=9.0）、EDTA 抗原修復(fù)液（pH=8.0）、蘇木素染液、蘇木素分化液、蘇木素返藍(lán)液、組化試劑盒DAB 顯色劑（Servicebio，貨號分別為G1202、G1203、G1206、G1004、G1309、G1340、G1211）；TRIeasyTMTotal RNA Extraction Reagent TRIeasyTM總RNA 提取試劑（YEASEN，貨號19926940）；Hyper ScriptⅢ RT Super Mix for qPCR with gDNA Remover、2×S6 Unlversal SYBR qPCR Mix（NovaBio，貨號分別為F2439、F3528）。

1.4 儀器

WPB PLT-UNR-RT-2 動物肺功能檢測系統(tǒng)（EMKA Beschlagteile）；RM2437 型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（Leica Biosystems）；組化筆（Servicebio）；顯微鏡，成像系統(tǒng)（Nikon）；FACSCANTO Ⅱ流式細(xì)胞儀（Becton，Dickinson and Company）；iQTM5型實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）儀（Bio-Rad）；Mark1509 酶標(biāo)儀（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 COPD大鼠模型制備

70 只Wistar 大鼠，隨機(jī)選取10 只作為空白對照組，其余大鼠作為造模組，采用香煙煙霧（CS）聯(lián)合氣管滴注脂多糖（LPS）法建立COPD 模型[14]。分別于第1、14 天行氣管插管，氣管滴注0.2 mL LPS（1 g·L-1）；第2-13、15-28 天，每次將10 只左右大鼠放置在容積為150 L（60 cm×50 cm×50 cm）的自制有機(jī)玻璃染毒箱內(nèi)進(jìn)行被動吸煙，每天1次，每次30 min，每只1支。造模結(jié)束后，空白對照組及造模組各隨機(jī)選取3 只大鼠進(jìn)行肺功能與肺組織病理檢測，以客觀評價本次模型。

2.2 分組及給藥

造模結(jié)束后，空白對照組常規(guī)喂養(yǎng)，造模組大鼠隨機(jī)分為模型對照組、陽性對照組及芪蛭皺肺顆粒高、中、低劑量組。給藥劑量參照《實驗藥理方法學(xué)》，大鼠給藥劑量=人臨床劑量/70 kg×6.3[15]。第29 天開始，按3.24、1.62、0.81 g·kg-1劑量分別給高、中、低劑量組大鼠灌胃芪蛭皺肺顆粒混懸液，陽性對照組給予醋酸地塞米松混懸液67.5 μg·kg-1，空白對照組和模型對照組給予等體積生理鹽水（10 mL·kg-1），持續(xù)給藥28天。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 觀察大鼠一般狀況

每日觀察大鼠呼吸情況，鼻腔分泌物，精神活動狀態(tài)，毛色，進(jìn)食、飲水量等。每周稱量并記錄大鼠體質(zhì)量。

2.3.2 肺功能

最后一次灌胃治療結(jié)束后，從SPF 級動物房取出大鼠。做好標(biāo)記，采用動物肺功能測試系統(tǒng)，清醒狀態(tài)下檢測吸氣峰流速（PIF）和呼氣峰流速（PEF）。

2.3.3 肺組織病理

各組大鼠肺功能檢測完成后，禁食24 h，3%戊巴比妥鈉（45 mg·kg-1）腹腔注射麻醉。腹主動脈取血，常溫，3500 r·min-1，離心15 min，制備血清。解剖出完整的肺和氣管，緩慢向氣管內(nèi)注入注射用生理鹽水1 mL，再緩慢吸出，重復(fù)2 次，回收支氣管肺泡灌洗液（BALF），無菌紗布過濾，置于離心管中，4℃，2000 r·min-1，離心5 min，取上清液。將血清、BALF 及部分肺組織置于-80冰箱中保存?zhèn)溆?，其余肺組織采用4%多聚甲醛固定，包埋，切片，脫蠟至水，蘇木素-伊紅（HE）染色，脫水，透明后中性樹膠封片，200 倍光鏡觀察肺組織病理變化。參考周勇等[16]的方法，根據(jù)支氣管壁破壞程度、炎性細(xì)胞浸潤程度、支氣管腔內(nèi)物質(zhì)（“有無”及“多少”）、支氣管周圍肺泡病理改變等進(jìn)行評分，無病變?yōu)? 分、輕度病變?yōu)? 分、中度病變?yōu)? 分、重度病變?yōu)?分。

2.3.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）檢測大鼠血清及BALF中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量

取出-80℃冰箱保存的血清及BALF，按ELISA 試劑盒說明書操作。

2.3.5 流式細(xì)胞儀檢測大鼠脾臟Th1/Th2細(xì)胞比例

取脾臟，研磨，200 目濾網(wǎng)濾過，制成單細(xì)胞懸液，緩慢加入大鼠淋巴細(xì)胞分離液，2500 r·min-1，離心20 min，調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度為每毫升1×106個。加入CD4 抗體，4℃避光孵育30 min，用流式緩沖液洗滌，用破膜溶液對細(xì)胞固定破膜，分別加入藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的IL-4 及Alexa Fluor 647 標(biāo)記的IFN-γ 進(jìn)行染色，4℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測Th1、Th2 細(xì)胞表達(dá)水平，分析Th1/Th2亞群比例。

2.3.6 免疫組織化學(xué)法（Immunohistochemistry，IHC）檢測肺組織Notch1蛋白表達(dá)

肺組織病理切片石蠟包埋，切片，脫蠟至水；枸櫞酸鹽緩沖液沖洗，高壓鍋煮沸，自然冷卻，PBS 沖洗，H2O2封閉；加Notch1 抗體（1:200 稀釋），室溫孵育；加二抗后37℃孵育30 min，DAB 顯色；自來水沖洗，蘇木素復(fù)染數(shù)秒；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固；光學(xué)顯微鏡（×400）下隨機(jī)選取1個視野，以棕黃色為陽性染色，用Image-pro Plus 軟件測定總的光密度值（IOD）。

2.3.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測肺組織Notch1、Hes1、Hey1蛋白表達(dá)

取出-80℃冰箱保存的肺組織，4℃冰箱解凍后加入RIPA 裂解液，經(jīng)組織研磨儀研磨后，12000 r·min-1離心15 min，取上清液，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。上樣，80 V 電泳30 min，110 V 電泳1 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜，設(shè)置電流25 mA、15 min。5%脫脂奶粉室溫下封閉4 h，加入鼠一抗Notch1（1∶1000 稀釋），兔一抗Hes1（1∶1000 稀釋）、Hey1（1∶2000 稀釋）和內(nèi)參β-actin（1∶5000 稀釋），4℃孵育過夜。分別加入羊抗小鼠二抗（1:5000）及羊抗兔二抗（1∶5000），室溫?fù)u床孵育2 h，增強化學(xué)發(fā)光法顯色，并用Image J 軟件分析各組蛋白相對表達(dá)水平。

2.3.8 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）檢測肺組織Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)

取出-80℃冰箱保存的肺組織，4℃冰箱解凍后，用總RNA 提取試劑提取肺組織總RNA 并測定其濃度和純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按SYBR 試劑盒說明書和PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)變性95℃、30 s，PCR 擴(kuò)增40個循環(huán)，95℃變性10 s，60℃退火30 s；以β-actin 為內(nèi)參基因，根據(jù)2-ΔΔCt法計算Notch1、Hes1、Hey1 mRNA 的相對表達(dá)量。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，序列如下：①Notch1 上游引物：5’-GCCAGCAAGAAGAAGCGGAGAG-3’，下游引物：5’-CCACTCGTTCTGATTGTCGTCCATC-3’（108 bP）；②Hes1 上游引物：5’-CTAACGCAGTGTCG CCTTCCAG-3’，下游引物：5’-AGAGAGGTGGGCTA GGGAGTTTATG-3’（116 bP）；③Hey1 上游引物：5’-C GGGAATGCCTGGCTGAAGTTG-3’，下游引物：5’-GGGATGCGTAGTTGTTGAGATGGG-3’（109 bP）；④β-actin 上游引物：5’-GGAGATTACTGCCCTGGCTC CTA-3’，下游引物：5’-GACTCATCGTACTCCTGCT TGCTG-3’（150 bP）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般情況

造模過程中空白對照組大鼠無死亡，造模組大鼠因氣管插管致2 只死亡，麻醉致2 只死亡，煙熏過程中4 只死亡，造模結(jié)束隨機(jī)選取空白對照組與造模組各3 只用于驗證模型是否成功；灌胃給藥過程中無大鼠死亡。最終各組大鼠數(shù)量情況如下：空白對照組7只，模型對照組10 只，陽性對照組10 只，芪蛭皺肺高劑量組10 只，芪蛭皺肺中劑量組10 只，芪蛭皺肺低劑量組9只。

空白對照組大鼠呼吸狀態(tài)平穩(wěn)，精神情況良好，皮毛顏色正常有光澤，體質(zhì)量勻速增長。28 天造模過程中，造模組大鼠逐漸出現(xiàn)喘促、鼻中分泌物由稀薄變粘稠等呼吸系統(tǒng)癥狀，伴有不同程度的毛色萎黃，此外出現(xiàn)活動力下降、體質(zhì)量增長緩慢等。經(jīng)28天灌胃治療后，芪蛭皺肺高、中劑量組大鼠喘促等癥狀減輕，鼻腔分泌物逐漸減少，精神活動狀態(tài)良好，皮毛逐漸恢復(fù)光澤；低劑量組大鼠一般狀況改善不明顯。

3.2 對COPD大鼠肺功能的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠PIF、PEF 顯著降低（P<0.05）；與模型對照組比較，陽性對照組及芪蛭皺肺高、中、低劑量組PIF、PEF 顯著升高（P<0.05）；與陽性對照組比較，芪蛭皺肺中、低劑量組PIF、PEF顯著降低（P<0.05）。見表1。

表1 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠肺功能的影（±s）

表1 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠肺功能的影（±s）

注：與空白對照組比較，$P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與陽性對照組比較，*P<0.05。

組別空白對照組模型對照組陽性對照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組n PEF（mL·s-1）43.57±8.85 6.71±0.47$36.59±5.35#34.81±4.34#25.04±3.24#*15.46±2.06#*7 10 10 10 10 9 PIF（mL·s-1）37.45±3.38 5.84±0.64$32.80±3.76#30.51±2.05#24.14±2.60#*15.86±1.89#*

3.3 對COPD大鼠肺組織病理變化的影響

空白對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，少量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管腔內(nèi)可見少量嗜酸性物質(zhì)，小面積肺組織出血，可能是灌胃生理鹽水時因操作不當(dāng)造成的損傷。模型對照組大鼠肺組織可見多灶性肺泡壁增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管可見上皮細(xì)胞壞死，核固縮，胞質(zhì)空泡化，管腔內(nèi)可見嗜酸性物質(zhì)。陽性對照組可見中等面積肺泡壁增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管少量上皮細(xì)胞壞死，核固縮，胞質(zhì)空泡化，管腔內(nèi)可見少量壞死脫落的上皮細(xì)胞及嗜酸性物質(zhì)。芪蛭皺肺高劑量組可見炎性細(xì)胞浸潤，支氣管少量上皮細(xì)胞壞死，核固縮，胞質(zhì)空泡化，管腔內(nèi)少量壞死脫落的上皮細(xì)胞，未見明顯嗜酸性物質(zhì)。中劑量組多灶性肺泡壁增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管上皮細(xì)胞壞死，核固縮，胞質(zhì)空泡化。低劑量組可見肺泡擴(kuò)張，肺泡壁大面積增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管可見上皮細(xì)胞水樣變性，胞質(zhì)疏松淡染，管腔內(nèi)少量嗜酸性物質(zhì)（見圖1）。

圖1 芪蛭皺肺顆粒對COPD模型大鼠肺組織病理學(xué)影響（HE，×200）

空白對照組肺組織病理半定量評分為（1.21±0.26）分，模型對照組為（2.65±0.52）分，陽性對照組為（1.44±0.37）分，芪蛭皺肺高劑量組為（1.51±0.41）分，中劑量組為（1.70±0.45）分，低劑量組為（1.93±0.48）分。與空白對照組相比，模型對照組半定量評分顯著升高（P<0.05）；與模型對照組相比，陽性對照組及芪蛭皺肺顆粒高、中、低劑量組評分顯著降低（P<0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3.4 對COPD大鼠血清及BALF中TNF-α含量的影響

與空白對照組相比，模型對照組大鼠血清及BALF 中TNF-α 含量均顯著升高（P<0.05）。與模型對照組相比，陽性對照組及芪蛭皺肺高、中、低劑量組血清及BALF 中TNF-α 含量均顯著降低（P<0.05）。與陽性對照組比較，芪蛭皺肺中、低劑量組血清及BALF 中TNF-α含量均顯著升高（P<0.05）（見表2）。

表2 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠血清及BALF中TNF-α含量的影響（±s）

表2 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠血清及BALF中TNF-α含量的影響（±s）

注：與空白對照組比較，$P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與陽性對照組比較，*P<0.05。

n BALF（pg·mL-1）73.44±5.23 179.90±8.47$98.27±6.20#109.75±6.07#125.45±6.85#*153.33±7.50#*組別空白對照組模型對照組陽性對照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組7 10 10 10 10 9血清（pg·mL-1）55.38±5.08 153.51±6.83$83.61±5.69#96.56±5.22#118.85±5.78#*132.81±5.21#*

3.5 對COPD大鼠脾臟Th1/Th2細(xì)胞比例的影響

與空白對照組相比，模型對照組大鼠脾臟Th2 細(xì)胞水平明顯升高，Th1 水平明顯下降，Th1/Th2 細(xì)胞比例呈不均衡狀態(tài)（均為P<0.05）。與模型對照組相比，陽性對照組及芪蛭皺肺高、中劑量組Th2 細(xì)胞水平明顯降低（均為P<0.05）；陽性對照組及芪蛭皺肺高、中、低劑量組Th1水平均明顯升高，Th1/Th2比例逐漸恢復(fù)平衡（均為P<0.05）。與陽性對照組比較，芪蛭皺肺高、中、低劑量組Th2 水平明顯升高，Th1 水平明顯降低（P<0.05）（見表3，圖2、圖3）。

圖2 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠脾臟中Th2細(xì)胞比例的影響

圖3 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠脾臟中Th1細(xì)胞比例的影響

表3 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠脾臟Th1/Th2細(xì)胞比例的影響（±s）

表3 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠脾臟Th1/Th2細(xì)胞比例的影響（±s）

注：與空白對照組比較，$P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與陽性對照組比較，*P<0.05。

Th1/Th2 3.25±0.11 0.23±0.01$2.29±0.10#1.48±0.01#*0.58±0.01#*0.41±0.02#*組別空白對照組模型對照組陽性對照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組n 7 10 10 10 10 9 Th1（%）4.63±0.17 1.31±0.10$3.47±0.09#2.88±0.11#*2.31±0.12#*2.15±0.14#*Th2（%）1.42±0.05 5.70±0.71$1.52±0.10#1.95±0.09#*3.97±0.24#*5.19±0.11*

3.6 芪蛭皺肺顆粒對COPD 大鼠肺組織Notch1 蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比，模型對照組大鼠肺組織Notch1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與模型對照組相比，陽性對照組及芪蛭皺肺顆高、中劑量組Notch1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與陽性對照組相比，芪蛭皺肺低劑量組Notch1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）（見表4，圖4）。

圖4 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠肺組織Notch1蛋白表達(dá)的影響（免疫組化，×400）

表4 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠肺組織Notch1蛋白表達(dá)的影響（±s）

表4 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠肺組織Notch1蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與空白對照組比較，$P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與陽性對照組比較，*P<0.05。

Notch1 0.02±0.01 0.22±0.04$0.11±0.02#0.10±0.01#0.14±0.01#0.18±0.02*組別空白對照組模型對照組陽性對照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組n 7 10 10 10 10 9

3.7 芪蛭皺肺顆粒對COPD 大鼠肺組織Hes1、Hey1蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組相比，模型對照組大鼠肺組織Hes1、Hey1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）；與模型對照組相比，陽性對照組及芪蛭皺肺高、中、低劑量組Hes1、Hey1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）；與陽性對照組相比，芪蛭皺肺低劑量組Hes1蛋白表達(dá)水平顯著降低，中、低劑量組Hey1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）（見表5，圖5）。

圖5 各組大鼠肺組織Hes1、Hey1蛋白表達(dá)電泳

表5 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠肺組織Hes1、Hey1蛋白相對表達(dá)量的影響（±s）

表5 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠肺組織Hes1、Hey1蛋白相對表達(dá)量的影響（±s）

注：與空白對照組比較，$P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與陽性對照組比較，*P<0.05。

Hey1/β-actin 0.38±0.03 0.81±0.04$0.56±0.03#0.56±0.02#0.68±0.02#*0.70±0.02#*組別空白對照組模型對照組陽性對照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組n 7 10 10 10 10 9 Hes1/β-actin 0.38±0.02 0.72±0.04$0.39±0.02#0.39±0.01#0.45±0.02#0.49±0.03#*

3.8 對COPD 大鼠肺組織Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)的影響

與空白對照組比較，模型對照組大鼠肺組織Notch1、Hes1、Hey1 mRNA 表達(dá)明顯升高（P<0.05）；與模型對照組比較，陽性對照組及芪蛭皺肺高、中、低劑量組Notch1、Hey1 mRNA 表達(dá)明顯降低，陽性對照組及芪蛭皺肺高、中劑量組Hes1 mRNA 表達(dá)明顯降低（均為P<0.05）；與陽性對照組比較，芪蛭皺肺中、低劑量組Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）（見表6）。

表6 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠肺組織Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)的影響（±s）

表6 芪蛭皺肺顆粒對COPD大鼠肺組織Notch1、Hes1、Hey1 mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：與空白對照組比較，$P<0.05；與模型對照組比較，#P<0.05；與陽性對照組比較，*P<0.05。

組別空白對照組模型對照組陽性對照組芪蛭皺肺高劑量組芪蛭皺肺中劑量組芪蛭皺肺低劑量組n Hey1 1.00±0.08 2.16±0.09$1.21±0.07#1.25±0.03#1.66±0.05#*1.88±0.06#*7 10 10 10 10 9 Notch1 1.00±0.06 2.51±0.10$1.46±0.05#1.52±0.03#1.85±0.13#*2.23±0.04#*Hes1 1.01±0.13 1.92±0.06$1.29±0.05#1.29±0.02#1.59±0.07#*1.83±0.05*

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為COPD 屬“肺脹”“咳嗽”“喘證”等范疇，以咳嗽咳痰、胸悶脹滿、氣促喘急等為主要癥狀，嚴(yán)重者有燥煩感，甚至出現(xiàn)驚厥、喘脫等危候[17]?！兜は姆āた人浴吩唬骸胺蚊浂取颂祾娥鲅K氣而病。”[18]COPD 病機(jī)特點可概括為本虛標(biāo)實，肺脾腎三臟虛損，痰瘀交阻。COPD 穩(wěn)定期以虛為主兼見痰瘀，治療以補正扶虛為主。急性加重階段（Acute exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）以痰瘀為主兼見正虛，治療以宣肺祛邪為主，降氣化痰，活血化瘀[19]。COPD 的治療目前臨床尚無特效藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)療法常伴有并發(fā)癥及不良反應(yīng)，且經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)較重，亟需探索更為安全有效的治療方法。芪蛭皺肺顆粒根據(jù)COPD 本虛標(biāo)實的病機(jī)特點研制而成，組方中黃芪補氣固本益肺，水蛭破血逐瘀通經(jīng)；黨參益肺健脾，丹參、赤芍活血祛瘀；白芥子溫中散寒止咳，枳實破氣化痰，桔?；抵箍绕酱晃逦蹲蛹{氣定喘、斂肺止咳，麥冬潤肺養(yǎng)陰。諸藥共奏益氣活血逐痰、理肺除脹平喘之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪有效成分黃芪多糖、黃芪甲苷，可誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ），發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[20]，黃芪多糖可有效減輕COPD 大鼠炎癥反應(yīng)[21]；水蛭具有抗炎、抗凝血、抗血栓作用[22]，重組水蛭素可減輕COPD 大鼠氣道重塑[23]；黨參具有免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用[24]，可緩解COPD 小鼠氣道炎癥[25]；丹參具有抗血栓、抗腫瘤等作用[26]，丹參酮ⅡA 可減輕COPD 大鼠炎癥反應(yīng)等[27]。課題組前期研究表明，芪蛭皺肺顆粒能夠抑制COPD 大鼠白細(xì)胞介素4（Interleukin-4，IL-4）功能亢進(jìn)，同時促進(jìn)IFN-γ 的表達(dá)，恢復(fù)Th1/Th2 免疫平衡，從而減輕肺組織及氣道炎癥[8]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚未完全闡明COPD 發(fā)病機(jī)制，炎癥反應(yīng)及免疫紊亂是導(dǎo)致發(fā)病的重要原因之一，T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的過度免疫反應(yīng)在COPD 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[28]。COPD 存在氣道及肺實質(zhì)的慢性炎癥，慢性炎癥狀態(tài)使得T淋巴細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)化和激活，造成免疫紊亂，激活的Th1、Th2、Th17、Treg 等細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎性介質(zhì)，對氣道及肺實質(zhì)進(jìn)行破壞[29]。T淋巴細(xì)胞可分化為Th1和Th2細(xì)胞，兩者在功能上相互拮抗，機(jī)體正常時處于動態(tài)平衡狀態(tài)。COPD 發(fā)病階段Th1細(xì)胞在COPD穩(wěn)定期優(yōu)勢表達(dá)，而Th2細(xì)胞在AECOPD 階段優(yōu)勢表達(dá)，Th1/Th2 免疫失衡使得炎癥反應(yīng)加劇[30]。恢復(fù)Th1/Th2 免疫平衡對COPD 的治療尤為關(guān)鍵。Notch 信號通路介導(dǎo)細(xì)胞靠近接觸之后的活化效應(yīng)，4 個受體Notch1/2/3/4 和5 個配體Delta1/3/4、Jagged1/2均為表達(dá)于T淋巴細(xì)胞等成熟免疫細(xì)胞表面的單跨膜蛋白；當(dāng)受體與配體結(jié)合后，具有轉(zhuǎn)錄活性的胞內(nèi)段NICD 被釋放，與轉(zhuǎn)錄因子CSL 結(jié)合，從而激活下游靶基因Hes 和Hey 家族，最終影響T 淋巴細(xì)胞的分化與凋亡等[5,31]。有研究表明，2 型先天性淋巴樣細(xì)胞（ILC2s）可以通過激活Notch/GATA3 信號通路促進(jìn)AECOPD 階段Th2 細(xì)胞的分化[32]。Notch 信號通路在肺部疾病發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。研究表明，Notch 信號通路激活介導(dǎo)的klotho 甲基化通過加重炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡促進(jìn)COPD 發(fā)展[33]。在未成熟的內(nèi)皮細(xì)胞中，Notch1 是COPD 肺微血管再生的潛在標(biāo)志物[34]。COPD 發(fā)病前可在氣腫性肺組織中觀察到肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常凋亡，MiR-34a 通過調(diào)節(jié)Notch1 減輕CS 誘導(dǎo)的肺內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[35]。而Notch1在COPD 中還可通過細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）途徑調(diào)節(jié)CS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[36]。長基因間非編碼RNA00612（LINC00612）可通過調(diào)節(jié)血清微小核糖核酸-31-5p（miR-31-5p）/Notch1 信號通路減輕人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞株（hpmec）凋亡，炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[37]。異硫氰酸烯丙酯（Allyl isothiocyanate，AITC）可通過Notch1 信號通路上調(diào)多藥耐藥蛋白（MRP1）含量，從而減輕癥狀[38-39]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）是常用COPD 治療劑，Notch 信號通路通過磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）途徑緩解CS 誘導(dǎo)的BM-MSCs 功能障礙[40]。Notch 信號通路介導(dǎo)的Th1/Th2免疫失衡是COPD發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制。

肺功能及組織病理學(xué)是COPD 模型成功的金標(biāo)準(zhǔn)[41]。本研究根據(jù)采用香煙煙霧聯(lián)合氣管滴注LPS 法建立COPD模型，造模后給藥前空白對照組及造模組各隨機(jī)選取3只大鼠進(jìn)行肺功能及組織病理學(xué)檢測，肺功能及組織病理學(xué)結(jié)果均提示本次造模成功。經(jīng)給藥干預(yù)后，肺功能結(jié)果顯示，與正常對照組比較，造模組大鼠PIF、PEF值均明顯降低；肺組織病理切片顯示，造模組大鼠肺組織與氣道出現(xiàn)支氣管及其周圍肺泡的病變。經(jīng)給藥干預(yù)后，空白對照組大鼠及COPD模型大鼠肺功能及病理切片結(jié)果與造模后給藥前的結(jié)果相一致。

TNF-α 可放大COPD 炎癥過程，參與氣道炎癥狀態(tài)的形成，其表達(dá)伴隨氣道炎癥狀態(tài)加重而增加[42]。與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清及BALF 中TNF-α 含量顯著升高，提示COPD 大鼠肺組織及氣道有慢性炎癥反應(yīng)。COPD 發(fā)病過程中存在免疫細(xì)胞分化及功能的紊亂[43]，Notch信號通路在調(diào)節(jié)呼吸系統(tǒng)疾病Th1/Th2 免疫失衡中發(fā)揮重要作用[44]，Notch 信號通路過度激活介導(dǎo)的Th1 和Th2 細(xì)胞失衡是COPD 重要發(fā)病機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型對照組存在Th1/Th2 免疫失衡，平衡向Th2 方向移動，提示COPD 發(fā)病過程中存在免疫紊亂。與空白對照組比較，模型對照組大鼠肺組織Notch1、Hes1、Hey1蛋白及mRNA 表達(dá)顯著升高，提示Notch 信號通路在COPD大鼠體內(nèi)被激活，參與發(fā)病過程。

芪蛭皺肺顆?？赡芡ㄟ^抑制Notch 信號通路過度表達(dá)，進(jìn)而促使Th1/Th2 免疫平衡恢復(fù)，對COPD 發(fā)揮抗炎及保護(hù)肺功能的作用。研究結(jié)果表明，與模型對照組大鼠比較，芪蛭皺肺高、中、低劑量組大鼠血清及BALF 中TNF-α 含量顯著降低，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示Th1/Th2 免疫平衡得到一定恢復(fù)，平衡向Th1 方向移動，提示芪蛭皺肺顆粒通過調(diào)節(jié)Th1/Th2 免疫平衡從而減輕炎癥反應(yīng)；IHC、Western blot 及PCR 結(jié)果顯示，與模型對照組大鼠比較，芪蛭皺肺高、中、低劑量組大鼠Notch1、Hes1、Hey1 蛋白及mRNA 表達(dá)顯著降低，提示芪蛭皺肺顆粒通過抑制Notch 信號通路激活發(fā)揮對COPD 的治療作用。芪蛭皺肺高、中、低劑量組支氣管及其周圍肺泡病變均有所改善，組織結(jié)構(gòu)逐漸趨于正常，各給藥組PIF、PEF 顯著升高，佐證了芪蛭皺肺顆粒對肺組織結(jié)構(gòu)及肺功能的保護(hù)作用。

綜上所述，芪蛭皺肺顆粒可調(diào)節(jié)COPD 大鼠免疫功能，減輕肺組織及氣道炎癥，其作用機(jī)制可能是通過抑制Notch 信號通路的過度表達(dá)，進(jìn)而促使Th1/Th2恢復(fù)平衡。本研究從免疫炎癥角度為芪蛭皺肺顆粒治療COPD 提供了理論依據(jù)，但未對組成成分深入分析，今后需進(jìn)一步探索其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，完善藥效、毒理實驗；此外，中醫(yī)藥治療COPD 靶點較多，需繼續(xù)探究芪蛭皺肺顆粒防治COPD 的干預(yù)靶點，為臨床應(yīng)用提供參考。