枸杞葉改善D-半乳糖致亞急性衰老小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的效應(yīng)部位與作用機制研究＊

仝佳祥，陳 楊，李 璇，朱梓強，宿樹蘭，郭 盛，康宏杰，段金廒，朱 悅＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省方劑研究重點實驗室/江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心/江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210023；2.寧夏枸杞創(chuàng)新中心 銀川 750000）

枸杞葉為茄科枸杞屬植物寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）與枸杞（L.chinenseMill.）的嫩莖葉，其藥用記載始見于南朝宋《名醫(yī)別錄》“冬采根，春、夏采葉，秋采莖實”[1]。唐·孫思邈《備急千金要方》將其功效概括為“補虛羸，益精髓”[2]。五代《藥性論》記載“子葉同說，味甘平。補益精，諸不足”，認(rèn)為其功效與枸杞子類似[3]，《日華子本草》進一步描述其具有“除煩益志”“壯心氣”功效[4]。現(xiàn)代《中藥大詞典》及《中華本草》將其功效總結(jié)為“補虛益精，清熱明目”[5-6]。

現(xiàn)代研究表明，枸杞葉富含黃酮類[7]、酚酸類[8]、多糖類及生物堿類成分[9-10]，其活性成分種類與枸杞子相似，而黃酮類成分含量甚至超過枸杞子[11]。同時研究發(fā)現(xiàn)枸杞葉具有抗氧化[12]、抗疲勞[13]，調(diào)節(jié)血糖血脂[14-15]、神經(jīng)保護[16]、抗腫瘤等生物活性[17]，是具有高度開發(fā)利用價值的藥食兩用資源。為了深入挖掘其資源利用價值，基于其“補虛益精”的傳統(tǒng)功效，構(gòu)建D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型，評價枸杞葉對衰老模型小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的影響并探索效應(yīng)部位與作用機制，為枸杞葉資源化利用與相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

本實驗使用SPF 級，體質(zhì)量為25-30 g 的雄性ICR小鼠，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（滬）2022-0004。本實驗獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（202211A006）。

1.2 藥物

枸杞葉（Lycium barbarumleaves，批號：2208153）采購自寧夏明德中藥飲片有限公司，經(jīng)過段金廒教授鑒定為合格藥材。

1.3 試劑

多奈哌齊（E120086）購自薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；凝膠制備試劑盒（PG112）購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；蛋白酶抑制劑（Cocktail，HY-K0011）購自MCE 公司；小鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒（AF2132-A）、小鼠γ 干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒（AF2182-A）、小鼠白介素10（IL-10）ELISA 試劑盒（AF2176-A）、小鼠白介素1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（AF2040-A）、小鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）ELISA 試劑盒（AF2204-A）、小鼠神經(jīng)生長因子（NGF）ELISA 試劑盒（AF2147-A）、小鼠膠質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）ELISA 試劑盒（AF2110-A）購自湖南艾方生物科技有限公司；還原性谷胱甘肽（GSH）檢測試劑盒（A006-2-1）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（A003-1-2）、小鼠超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（A001-3-2）購自南京建成生物工程研究所；TUNEL 凋亡檢測試劑盒（A112-01）購自南京諾唯贊生物科技公司；抗體Caspase-9（Mouse mAb 9508S）、Nrf2（Rabbit mAb 12721S）購自Cell Signaling Technology（CST）公司；抗體Caspase-3（66470-2-lg）、HO-1（10701-1-AP）、β-actin（66009-1-lg）購自武漢三鷹生物技術(shù)公司；二抗HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)（BA1054）、HRP Conjugated AffiniPure Goat Antimouse IgG (H+L)（BA1050）購自BOSTER公司。

1.4 實驗儀器

動物行為學(xué)分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技有限公司）；微孔板恒溫振蕩器（ST60-4，Thermo 公司）；高速冷凍離心機（D1524R，大龍興創(chuàng)實驗儀器公司）；多功能酶標(biāo)儀（Enspire，Perkin-Elmer 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDocTMXRS+Imaging System，Bio-Rad 公司）；干式恒溫金屬浴（SBH130D，STUART 公司）；熒光倒置顯微鏡（AXIO Vert.A1，Zeiss公司）。

2 方法

2.1 枸杞葉提取部位的制備

取枸杞葉500 g，加入10 倍量水，進行兩次回流提取，微沸計時提取2 h，將兩次提取后的濾液合并后過濾濃縮，然后將濃縮液放入凍干機，得到枸杞葉水提部位（ST）；按上述操作及圖1 樣品制備流程圖依次制備枸杞葉75%乙醇提取部位（CT）、80%醇沉上清部位（SQ）及80%醇沉沉淀部位（CD），經(jīng)計算求得枸杞葉水提部位（ST）得率為31.23%、枸杞葉75%乙醇提取部位（CT）得率為21.71%、80%醇沉上清部位（SQ）得率為17.68%、80%醇沉沉淀部位（CD）得率為15.75%。

圖1 枸杞葉不同溶劑提取部位制備流程圖

圖2 各組小鼠Y迷宮運動軌跡圖

2.2 D-半乳糖致亞急性衰老小鼠模型構(gòu)建、分組及給藥

將100 只雄性ICR 小鼠隨機設(shè)置為空白組、模型組、枸杞葉水提物低劑量組（ST-L）、枸杞葉水提物高劑量組（ST-H）、枸杞葉75%醇提物低劑量組（CT-L）、枸杞葉75%醇提物高劑量組（CT-H）、枸杞葉水提80%醇沉上清低劑量組（SQ-L）、枸杞葉水提80%醇沉上清高劑量組（SQ-H）、枸杞葉水提80%醇沉沉淀低劑量組（CD-L）、枸杞葉水提80%醇沉沉淀高劑量組（CD-H）以及陽性藥組多奈哌齊（Donepezil），除空白組10 只外，其余每組9 只。除空白組外，其余組通過頸背部皮下注射D-半乳糖（500 mg·kg-1·d-1）8 周建立亞急性衰老小鼠模型。D-半乳糖（500 mg·kg-1·d-1）通過0.9%生理鹽水配制濃度為50 mg·mL-1，給藥體積為10 ml·kg-1，造模8 周動物出現(xiàn)學(xué)習(xí)與記憶損傷后進行灌胃給藥。枸杞葉根據(jù)《寧夏中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中人用每日生藥量15 g，通過人與小鼠體表面積換算系數(shù)得到小鼠給藥劑量，其中低劑量組劑量（2.25 g·kg-1）根據(jù)枸杞葉人用日常劑量設(shè)置、高劑量組劑量（4.5 g·kg-1）根據(jù)枸杞葉人用日常劑量的2 倍設(shè)置。提取物用0.9%生理鹽水配制，給藥濃度分別為0.255 g·mL-1、0.45 g·mL-1，給藥體積為10 ml·kg-1。枸杞葉不同溶劑提取部位給藥劑量均按照得率折算為相應(yīng)生藥量。陽性藥組（Donepezil）通過0.9%生理鹽水配制給藥濃度為0.2 mg·mL-1，給藥體積為10 ml·kg-1。動物分組及給藥情況見表1。給藥周期為四周，之后進行行為學(xué)測試并解剖，每組取3 只進行心臟灌注，取全腦固定，剩余小鼠分離海馬組織，進行后續(xù)生化指標(biāo)檢測。

表1 動物實驗給藥劑量

2.3 行為學(xué)測試

Y 迷宮（Y-maze）實驗：將Y 迷宮三個臂隨機設(shè)置為新異臂、起始臂和其他臂。訓(xùn)練期將新異臂用隔板阻擋，小鼠由起始臂放入，自由探索起始臂和其他臂5 min。間隔1 h 后打開新異臂的擋板，小鼠由起始臂放入，在三個臂中自由探索5 min，采用VisuTrack 軟件分析小鼠進入新異臂的次數(shù)和時間。每只小鼠在測試前用75%酒精擦拭實驗裝置以消除氣味影響。

新物體識別（Novel object recognition，NOR）實驗：測試分三個階段進行。第一階段為適應(yīng)期，小鼠在實驗裝置內(nèi)自由探索10 min；第二階段為熟悉期，在實驗裝置對稱角落位置放入兩個完全相同的物體，將小鼠背朝物體并從距物體等距離處放入實驗裝置，小鼠自由探索5 min后取出小鼠，間隔1 h后進行下一階段實驗；第三階段為測試期，將兩個相同物體中的一個物體替換為一個形狀、顏色、材質(zhì)都不同的新物體，同樣將小鼠背朝物體并從距物體等距離處放入實驗裝置內(nèi)自由探索5 min，采用VisuTrack軟件分析小鼠在此期間對新物體和舊物體的探索時間及探索次數(shù)[18]。每只小鼠在測試前用75%酒精擦拭實驗裝置以消除氣味影響。

2.4 腦組織海馬區(qū)HE及尼氏（Nissl）染色

行為學(xué)測試后，每組取3只小鼠麻醉，以PBS 溶液進行心臟灌注，斷頭取腦，將腦組織置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水，然后進行HE以及Nissl染色，在顯微鏡下對海馬組織進行病理觀察并拍照，采用Image J軟件統(tǒng)計單位面積下尼氏體染色陽性細(xì)胞數(shù)。

2.5 神經(jīng)營養(yǎng)類因子及炎癥因子含量測定

行為學(xué)測試后，取6只小鼠解剖取海馬組織，液氮速凍后稱取一定重量的小鼠海馬組織，加入10倍量的PBS，低溫研磨制備10%組織勻漿，3000 r·min-1，離心10 min，取10%勻漿上清液待測。按照湖南艾方生物ELISA 試劑盒說明書，測定小鼠海馬組織中神經(jīng)營養(yǎng)類因子BDNF、NGF、GDNF 水平及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10水平。

2.6 氧化應(yīng)激因子的測定

行為學(xué)測試后，取每組6只小鼠解剖取海馬組織，液氮速凍后稱取一定重量的小鼠海馬組織，按照重量加入10 倍體積PBS 緩沖液，低溫研磨制備組織勻漿，3000 r·min-1，離心10 min 后取上清液。按照試劑盒說明書，測定小鼠海馬組織中氧化因子SOD 的活力以及MDA和GSH的含量。

2.7 Western blot 法檢測小鼠海馬組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)

稱取受試小鼠海馬組織，并將其加入10倍體積含有蛋白酶抑制劑Cocktail 的RIPA 蛋白裂解液中。之后，使用BCA 法來測定提取得到的組織總蛋白的濃度并制備蛋白樣品。采用10%蛋白凝膠試劑盒制備電泳凝膠，120 V 電泳2 h。轉(zhuǎn)膜條件：Nrf2，300 mA 120 min；β-Actin、HO-1，300 mA 60 min。5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應(yīng)一抗：Nrf2 Rabbit mAb（1∶2000）、HO-1 Rabbit PolyAb（1∶4000）、β-actin Mouse mAb（1∶10000），置于4℃冰箱過夜孵育后取出。TBST 洗膜3次，每次10 min。加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-mouse IgG（H+L）（1∶10000），HRP Conjugated AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG（H+L）（1∶10000）。TBST 洗膜后，通過ECL 化學(xué)發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)中顯影成像，使用Image J軟件對成像條帶進行定量分析。

2.8 TUNEL 法及Western blot 法分別檢測小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡及小鼠海馬組織Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)

依據(jù)行為學(xué)檢測結(jié)果，選擇行為學(xué)改善較為明顯的枸杞葉不同溶劑提取部位高劑量組小鼠腦組織石蠟切片，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，按照TUNEL試劑盒說明書進行染色，封片后置于熒光顯微鏡下觀察并拍照；按照“2.7”項下的方法檢測凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9 表達(dá)，轉(zhuǎn)膜條件：Caspase-3、Caspase-9，300 mA 60 min，一抗：Caspase-9 Mouse mAb（1:1000）、Caspase-3 Rabbit mAb（1:2000）。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

分別通過SPSS 20.0和GraphPad Prism 9統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析和作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間統(tǒng)計學(xué)分析采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 枸杞葉不同溶劑提取部位改善D-半乳糖致亞急性衰老小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的效用評價

小鼠給以枸杞葉提取部位四周后，采用Y 迷宮實驗及新物體識別實驗評價小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力（見圖2）。分析行為學(xué)測試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y迷宮實驗中，模型組小鼠對Y 迷宮中新異臂的探索次數(shù)和探索時間較空白組顯著降低（P<0.01）；與模型組相比，枸杞葉水提部位、75%醇提部位以及80%醇沉上清部位均能顯著上調(diào)小鼠對新異臂的探索次數(shù)及探索時間（P<0.01）（見圖3）。在新物體識別實驗中，模型組小鼠對新物體的時間分辨率與次數(shù)分辨率較空白組顯著降低（P<0.01）；枸杞葉各溶劑提取部位均能夠逆轉(zhuǎn)小鼠對新事物分辨率降低的趨勢（見圖4）。上述兩種行為學(xué)測試結(jié)果綜合表明，枸杞葉水提部位以及水提80%醇沉上清部位可顯著改善亞急性衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力，其作用趨勢與陽性藥多奈哌齊一致。

圖3 枸杞葉不同溶劑提取部位對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠Y迷宮行為學(xué)的影響（n=9）

圖4 枸杞葉不同溶劑提取部位對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠新物體識別行為學(xué)的影響（n=9）

3.2 枸杞葉不同溶劑提取部位對小鼠海馬區(qū)組織病理變化的影響

為了考察枸杞葉不同溶劑提取部位對模型小鼠腦組織海馬區(qū)組織病理變化的影響，對小鼠腦組織海馬區(qū)進行蘇木素-伊紅（HE）以及Nissl染色。如圖5所示，在HE 組織切片中，空白組細(xì)胞排列整齊均勻，核仁清晰。與空白組相比，模型組小鼠海馬去神經(jīng)元細(xì)胞排列較為松散，核固縮現(xiàn)象十分明顯，核仁模糊；與模型組相比，枸杞葉水提部位、75%醇提部位以及水提80%醇沉上清部位神經(jīng)元排列較為整齊，核固縮現(xiàn)象得到明顯改善，其中以水提部位高劑量組以及水提80%醇沉上清部位低、高劑量組改善作用最為顯著。

圖5 枸杞葉不同溶劑提取部位對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬區(qū)組織HE染色的影響（n=3）

如圖6 所示，在Nissl 染色組織切片中，空白組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)可見明顯深藍(lán)色斑塊狀尼氏體。與空白組相比，模型組小鼠海馬區(qū)尼氏體陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.01）；與模型組相比，枸杞葉水提部位、75%醇提部位和水提80%醇沉上清部位的高劑量組均可顯著增加小鼠海馬區(qū)尼氏體數(shù)目（P<0.05，P<0.01），作用趨勢與陽性藥多奈哌齊一致，其中以水提部位高劑量組效用最為顯著。

圖6 枸杞葉不同溶劑提取部位對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬區(qū)組織尼氏體染色的影響（n=3）

3.3 枸杞葉不同溶劑提取部位對小鼠海馬組織神經(jīng)營養(yǎng)類因子及炎性因子表達(dá)的影響

為了考察枸杞葉不同溶劑提取部位對模型動物海馬神經(jīng)營養(yǎng)類因子及炎性因子表達(dá)的影響，檢測海馬組織中神經(jīng)營養(yǎng)類因子BDNF、NGF 與GDNF 及炎癥因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-10 的表達(dá)。其中神經(jīng)營養(yǎng)類因子表達(dá)結(jié)果如圖7 顯示，模型小鼠海馬組織中BDNF、NGF、GDNF 含量較空白組顯著降低（P<0.01）；枸杞葉不同溶劑提取部位高劑量組均能明顯上調(diào)小鼠海馬組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)（P<0.05），作用趨勢與陽性藥多奈哌齊一致，其中水提部位以及水提80%醇沉上清部位高劑量組表現(xiàn)出較強的作用趨勢；炎癥因子表達(dá)結(jié)果如圖8顯示，與空白組相比，模型組小鼠海馬組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ表達(dá)顯著升高（P<0.01），抗炎細(xì)胞因子IL-10 表達(dá)顯著減少（P<0.01）；枸杞葉的水提部位、75%醇提部位以及水提80%醇沉上清部位的高劑量組均可顯著降低模型動物海馬中促炎因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ 表達(dá)（P<0.01），并且顯著增加抗炎細(xì)胞因子IL-10 的表達(dá)（P<0.01）。作用趨勢與陽性藥多奈哌齊一致，水提部位高劑量組表現(xiàn)出較強的作用趨勢。

圖7 枸杞葉不同溶劑提取部位對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬組織神經(jīng)營養(yǎng)類因子表達(dá)的影響（n=6）

圖8 枸杞葉不同溶劑提取部位對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬組織炎癥因子水平的影響（n=6）

3.4 枸杞葉不同溶劑提取部位對小鼠海馬組織氧化應(yīng)激因子的影響

為了考察枸杞葉不同溶劑提取部位對模型小鼠海馬氧化應(yīng)激的影響，檢測氧化應(yīng)激因子在小鼠海馬組織的活力或表達(dá)。結(jié)果如圖9 所示，模型組小鼠海馬組織中抗氧化物酶SOD 的活力和GSH 的含量較空白組顯著降低（P<0.01），脂質(zhì)過氧化物MDA的含量顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，枸杞葉水提部位顯著增強模型小鼠海馬組織中SOD 活力及GSH 的表達(dá)（P<0.01），下調(diào)MDA 的表達(dá)（P<0.01），枸杞葉水提部位高劑量組作用趨勢最強。

圖9 枸杞葉不同溶劑提取部位對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬組織氧化因子水平的影響（n=6）

3.5 枸杞葉不同溶劑提取部位對小鼠海馬組織抗氧化蛋白Nrf2、HO-1表達(dá)的影響

采用Western blot 法檢測小鼠海馬區(qū)抗氧化蛋白Nrf2 和HO-1 的表達(dá)水平。結(jié)果如圖10 顯示，模型組小鼠海馬組織中抗氧化通路蛋白Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平較對照組顯著降低，枸杞葉水提部位高劑量組Nrf2 和HO-1 的蛋白表達(dá)水平較模型組顯著增加（P<0.01），作用趨勢最強。

圖10 枸杞葉不同溶劑提取部位對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平的影響（n=6）

3.6 枸杞葉不同溶劑提取部位對小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡及凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9 表達(dá)的影響

依據(jù)行為學(xué)檢測結(jié)果，選擇行為學(xué)改善較為明顯的枸杞葉不同溶劑提取部位高劑量組石蠟切片，通過TUNEL 法檢測小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況，染色結(jié)果如圖11A 所示，對照組腦組織海馬區(qū)未見明顯陽性細(xì)胞，與對照組相比，模型組小鼠腦組織海馬區(qū)凋亡陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增多（P<0.01），表明模型小鼠腦組織海馬區(qū)存在明顯凋亡；與模型組相比，枸杞葉水提部位、75%醇提部位以及水提80%醇沉上清部位的高劑量組腦組織海馬區(qū)陽性細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.01），表明給藥后細(xì)胞凋亡程度明顯改善；采用Western blot 法檢測小鼠海馬區(qū)凋亡通路蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的表達(dá)水平，結(jié)果如圖11B 顯示，模型組小鼠海馬組織中凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平較對照組顯著升高，枸杞葉75%醇提低劑量組和水提80%醇沉上清部位高劑量組可顯著抑制Caspase-3 和Caspase-9 蛋白表達(dá)水平（P<0.05，P<0.01），作用趨勢最強。

圖11 枸杞葉不同溶劑提取部位對D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠海馬區(qū)凋亡的影響

4 討論

衰老是指機體器官功能隨著時間推移產(chǎn)生功能減退的生理過程。大腦功能衰退是機體衰老最顯著的癥狀之一，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)與記憶能力呈下降趨勢，甚至發(fā)展為老年癡呆癥等神經(jīng)退行性疾病，給國家、社會和家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。機體氧化應(yīng)激和炎性應(yīng)激水平的上升是機體衰老最為顯著的指標(biāo)與關(guān)鍵病理機制[19]。機體在衰老過程中會產(chǎn)生大量自由基，如果大量的自由基不能被及時清除，最終會導(dǎo)致自由基失衡從而引發(fā)氧化應(yīng)激，其產(chǎn)生的活性氧（Reactive oxygen species，ROS）不僅會對神經(jīng)元造成嚴(yán)重?fù)p傷，還可通過激活炎癥信號通路產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子來引發(fā)神經(jīng)炎癥加劇氧化應(yīng)激，導(dǎo)致惡性循環(huán)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，氧化應(yīng)激和炎性應(yīng)激會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)的海馬組織損傷，從而產(chǎn)生認(rèn)知障礙[21-22]，故抑制海馬神經(jīng)元的氧化與炎性應(yīng)激對于預(yù)防老年期癡呆癥的發(fā)生或延緩疾病進程，防止衰老過程中的認(rèn)知能力下降至關(guān)重要[23-24]。因此，預(yù)防氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡可能是治療年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的潛在治療策略。本研究采用D-半乳糖小鼠皮下注射構(gòu)建亞急性衰老動物模型。D-半乳糖過量攝入可產(chǎn)生過量ROS 以及抗氧化酶活性降低，導(dǎo)致機體氧化應(yīng)激加劇而加速衰老進程，是公認(rèn)并常用的亞急性衰老動物模型[25-27]。本研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠頸背部長期、大劑量皮下注射D-半乳糖后學(xué)習(xí)與記憶能力下降，并出現(xiàn)了行動遲緩與毛發(fā)稀疏等衰老特征，較好地模擬了人體的衰老。同時，D-半乳糖致亞急性衰老模型小鼠產(chǎn)生顯著氧化應(yīng)激、炎癥應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降、損傷小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元、神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、NGF、GDNF 表達(dá)下調(diào)、促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ 表達(dá)升高、抗炎細(xì)胞因子IL-10 表達(dá)減少、同時其氧化應(yīng)激因子抗氧化物酶SOD 的活力和GSH 的含量顯著降低、脂質(zhì)過氧化物MDA 的含量顯著升高，抗氧化通路Nrf2/HO-1 蛋白表達(dá)顯著降低，在細(xì)胞凋亡方面，表現(xiàn)為Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高。

中醫(yī)理論認(rèn)為年齡增長，腎精虧虛是導(dǎo)致衰老的根本原因。同時“腎通髓海”，腎藏精生髓而充于腦。腎精充足，髓海充盈，則腦健神明，耳聰目明，反應(yīng)靈活，記憶力強；反之，腎精虧虛，髓海失養(yǎng)，則易出現(xiàn)心煩、健忘等神志異常癥狀。因此補虛益精為中醫(yī)抗衰老并防治老年期癡呆的治本之法。枸杞葉在歷代多種本草典籍中均記載其具有“補虛益精”功效[28]。現(xiàn)代研究也證實了枸杞葉的神經(jīng)活性。韓懷欽等[29]研究發(fā)現(xiàn)寧夏無果枸杞葉水提物能夠促進海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞增殖，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。王長江等[30]研究發(fā)現(xiàn)枸杞葉總黃酮可通過提高機體氧化應(yīng)激水平、促進BDNF表達(dá)及減少細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗抑郁作用，徐龍飛[31]研究發(fā)現(xiàn)枸杞葉總黃酮具有改善染鉛小鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的效果，其機制可能與下調(diào)腦組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)有關(guān)。

本研究基于D-半乳糖所致亞急性衰老小鼠模型，系統(tǒng)考察了枸杞葉改善模型動物學(xué)習(xí)與記憶能力的效用部位。研究發(fā)現(xiàn)，枸杞葉的水提部位以及水提80%醇沉上清部位對模型動物的學(xué)習(xí)與記憶能力均有顯著提高作用，并可以改善模型小鼠海馬神經(jīng)元活力增加尼氏體數(shù)目，對小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷具有保護作用，其中以水提部位和80%醇沉上清部位高劑量組在改善模型動物的學(xué)習(xí)與記憶能力，增強海馬神經(jīng)元活力方面效用最為明顯；在上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)方面，同樣也是水提部位以及水提80%醇沉上清部位作用最為顯著；在中樞神經(jīng)炎癥調(diào)控方面，以枸杞葉水提部位高劑量組抑制促炎因子表達(dá)與提升抗炎因子表達(dá)效果最為顯著；在調(diào)控氧化應(yīng)激方面，枸杞葉水提物高劑量組提高抗氧化物酶活力、降低脂質(zhì)過氧化物含量，促進抗氧化蛋白表達(dá)方面效用最為明顯；在細(xì)胞凋亡方面，枸杞葉75%醇提低劑量組和水提80%醇沉上清部位高劑量組可顯著抑制凋亡通路蛋白Caspase-3 和Caspase-9 表達(dá)，減少模型小鼠腦組織海馬區(qū)細(xì)胞凋亡。綜上分析認(rèn)為，枸杞葉總水提部位與水提80%醇沉上清部位具有較強的改善衰老模型小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力的作用，并改善相關(guān)生化指標(biāo)。據(jù)文獻報道，枸杞葉中富含黃酮及酚酸類成分、多糖類成分、生物堿類等多種化學(xué)成分[32]，其中黃酮與多酚類成分含量高于枸杞果實，并具有清除自由基、抗氧化、抗炎及神經(jīng)保護作用等生物活性，被認(rèn)為是枸杞葉中的主要活性物質(zhì)。枸杞葉所含黃酮與酚酸類成分主要為蘆丁、槲皮素-3-O-蕓香糖苷-7-O-葡萄糖苷、綠原酸、新綠原酸以及咖啡酸等。研究表明綠原酸對腦組織氧化損傷具有保護作用，還可通過抗細(xì)胞凋亡以及抗β-淀粉樣蛋白生成，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[33]；諸多體內(nèi)外實驗證明，蘆丁可通過抗氧化、抗炎以及抗凋亡發(fā)揮其神經(jīng)保護作用[34]；咖啡酸可通過抑制氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF表達(dá)等改善Aβ 誘導(dǎo)的AD 小鼠模型學(xué)習(xí)與記憶功能障礙[35]。課題組前期研究表明，枸杞葉水提物、75%醇提物與水提80%醇沉沉淀上清部位中均含有上述類型成分，而水提80%醇沉淀部位中并不含有黃酮與酚酸成分。所以水提80%醇沉淀部位改善模型動物學(xué)習(xí)與記憶能力顯著弱于其余三種部位。在后續(xù)實驗研究中，將進一步采用活性跟蹤分離等手段，探索揭示行為學(xué)測試中改善模型動物學(xué)習(xí)與記憶能力作用趨勢最顯著的枸杞葉80%醇沉上清部位中的活性成分，進一步解析其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，以期為這一藥食兩用中藥材的臨床應(yīng)用提供更多的現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)，同時助力于枸杞資源的綜合利用與大健康產(chǎn)品開發(fā)。