基于網絡藥理學探討加味止哮平喘湯治療支氣管哮喘的作用機制

曹 悅 王 鵬 劉 施 楊宏志

1.湖北中醫藥大學中醫臨床學院，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫院肺病科，湖北 武漢 430061；3.湖北省中醫院藥事部，湖北 武漢 430061；4.湖北中醫藥大學第一臨床學院，湖北 武漢 430061

支氣管哮喘（下文簡稱“哮喘”）是一種由多種炎性細胞因子及其成分參與的呼吸道異質性臨床綜合征[1-2]，氣道高反應性和可逆的呼氣氣流受限是其顯著特點，且具有呼吸困難、氣短、胸悶和咳嗽的典型癥狀，這些癥狀隨時間和強度而變化[3]。全球有超過3 億哮喘患者，統計顯示其在任何年齡段皆可發病，且無明顯的性別差異[4]。

王鵬教授研究哮喘等呼吸系統疾病多年，結合臨床經驗和中醫經典創制了經驗方止哮平喘方。前期通過收集湖北省中醫院肺病科王鵬教授門診治療支氣管哮喘的中藥處方，借助中醫傳承輔助平臺進行數據挖掘總結及分析后得出核心處方—加味止哮平喘湯。其藥物組成為瓜蔞皮、法半夏、甘草、黃芩、柴胡、薤白、白芍、枳殼、射干、麻黃。

網絡藥理學具有多層次、多維度的特點，融合了生物學、藥理學、生物信息學等多門學科。通過構建“活性成分-靶點”網絡，從分子微觀層面預測中藥的作用機制，是對中醫藥的傳承性創新，宏觀與微觀相結合正符合現代中醫藥的發展趨勢，表明了中醫藥的科學性和有效性。本研究運用網絡藥理學的方法對加味止哮平喘湯的作用機制進行預測與分析，以期為新藥的研發提供一定的理論支持。

1 資料與方法

1.1 收集活性成分靶點和疾病靶點

將核心處方藥物輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），設置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，篩選出活性化合物及對應靶點，將核心藥物輸入中醫藥信息數據庫（traditional Chinese medicine information database，TCMID）進行補充。將所有靶點輸入UniProt 數據庫中進行規范化處理獲得gene symbol。在GeneCards、OMIM、CTD 及DisGenet 數據庫中獲取支氣管哮喘的潛在靶點，并通過UniProt 數據庫進行規范化處理。

1.2 活性成分-靶點網絡及蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡

運用R 軟件獲得藥物與疾病的交集靶點，聯合STRING 數據庫及Cytoscape 3.9.1 構建核心靶點的“活性成分-靶點”網絡圖及PPI 網絡圖。

1.3 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genome，KEGG）通路富集分析

運用R 軟件按照富集的數量和顯著程度（pvalue Cutoff=0.05，qvalue Cutoff=0.05），對交集基因進行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析，取前20 項繪制柱狀圖和點狀圖。

2 結果

2.1 收集活性成分靶點和疾病靶點

從TCMSP 數據庫中根據相應限制條件獲得核心處方的活性化合物，得到活性成分238 個，對應3608 個靶點，從TCMID 數據庫中獲得活性成分166個及相應靶點163 個，總共獲取活性成分404 個。靶點蛋白輸入UniProt 數據庫中轉化為相應基因名。在GeneCards、OMIM、CTD 及DisGenet 數據庫中獲得相應疾病基因，去除重復項后得到1351 個。

2.2 PPI網絡構建及富集分析

運用R 軟件獲得疾病及藥物基因的交集基因及韋恩圖，見圖1，取交集基因202 個。將交集基因輸入STRING 數據庫中，將物種設置為“ Homo sapiens”，置信度設為0.4，獲取靶點基因相互作用網絡，獲取tsv 文件，聯合Cytoscape 3.9.1 計算度值，獲取前30 位PPI 網絡圖，見圖2。

圖2 核心靶點PPI 網絡

2.3 GO功能富集分析及KEGGE通路富集分析

將交集基因進行GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析，共獲得180 條功能，179 條通路，根據Pvalue值選取前20 名繪制氣泡圖和柱狀圖，見圖3 ～6。

圖4 基因功能點狀圖

圖5 通路富集柱狀圖

圖6 通路富集點狀圖

2.4 成分-靶點網絡

運用Cytoscape 3.9.1 軟件構建活性成分-核心靶點網絡，見圖7。

圖7 成分-靶點網絡

3 討論

加味止哮平喘湯由瓜蔞薤白半夏湯、芍藥甘草湯、小柴胡湯、射干麻黃湯化裁組成。瓜蔞薤白半夏湯出自《金匱要略》：“胸痹不得臥，心痛徹背者”，陽氣虧虛，痰濁水飲內生，痰飲交阻胸膈，陰乘陽位，“陽微陰弦”，用瓜蔞薤白半夏湯寬胸理氣，通陽散結。芍藥甘草湯及小柴胡湯出自《傷寒論》，芍藥甘草湯具有養陰和營、緩急止痛的功效，能較好緩解哮喘發作時的氣道痙攣，同時能養肝血、調肝脾，培土生金。痰氣交阻胸膈，肝肺相連，引動肝風，胸脅苦滿、脹痛，用小柴胡湯和解少陽，柔肝緩急。射干麻黃湯出自《金匱要略》，主治寒痰郁肺證，具有宣肺散寒，化飲止咳的功效。

本研究將中醫藥系統性、整體性、宏觀性治療疾病與網絡藥理學多成分、多靶點、多通路的特點相結合，將現代學科技術與中醫藥結合，有利于對王鵬教授的學術經驗進行總結傳承與創新，為后續的研究奠定一定基礎。

加味止哮平喘湯療哮喘的核心靶點為絲氨酸/蘇氨酸激酶1（Serine/Threonine Kinase 1，AKT1）、轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）。AKT1能夠誘導哮喘患者氣道平滑肌細胞肥大，在哮喘發病中起關鍵作用[5-6]。STAT3 參與哮喘的發病，能夠誘導促炎細胞因子，促進哮喘發作[7-8]。IL-6 可誘發炎癥級聯反應，參與自身免疫反應[9]，IL-6/STAT3信號通路是治療哮喘的重要靶點，抑制其激活可減輕氣道重塑和炎癥反應[10-11]。

活性成分主要有川陳皮素、異鼠李素等。川陳皮素具有顯著抗炎作用，其可以抑制內質網應激信號通路和炎癥小體激活，減少促炎因子分泌，減輕哮喘大鼠的氣道炎癥反應[12-13]。異鼠李素可有效降低哮喘小鼠的炎癥因子表達[14]。

KEGG 通路主要富集磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶（phosphoinositied 3-Serine/Threonine Kinase，PI3K/Akt）信號通路，絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路。PI3K/Akt 信號通路參與氣道平滑肌中的細胞外基質沉積[15]，PI3K/Akt 參與MAPK 等多個靶點調控哮喘氣道黏液高分泌的過程[16]。有研究報道，調節PI3K/Akt 信號軸能有效減少炎性細胞在肺組織浸潤，抑制氣道炎癥和重構及杯狀細胞增生引起的黏液高分泌，從而改善哮喘癥狀[17-19]。

綜上所述，經過網絡藥理學分析，加味止哮平喘湯的主要活性成分川陳皮素、異鼠李素等，可能通過調控AKT1、STAT3、IL-6 等關鍵靶點，調控PI3K/Akt，MAPK 等信號通路，調節氣道炎癥，減輕氣道高反應，抑制氣道重塑。本研究將傳統中醫理念與現代研究相結合，符合中醫藥多成分、多角度、多靶點的特色，為今后臨床研究提供理論支持，但尚處于理論研究階段，后續仍需相關實驗驗證。