利用網絡藥理學和分子對接技術分析“貓爪草-冬凌草”對肝癌的治療作用機制

楊青斌 徐 靜 李 進 司維群 劉 靜 吳佳龍

1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550000；2.貴州中醫藥大學第二附屬醫院腫瘤科，貴州 貴陽 550000

肝癌指的是發生在肝臟的惡性腫瘤，主要包括轉移性肝細胞癌和原發性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。本文中的肝癌特指HCC。HCC 在我國惡性腫瘤疾病的排名靠前，其發病率位列第四位，致死率為第二位，嚴重威脅人類的生命健康[1]。HCC 治療面臨難度系數大、惡性高、中晚期療效差、病情進展快等困難[2]。從中醫學上講，機體正氣虧虛，肝失條達導致血痰凝滯，毒結不易化解遂發此癥[3]。中藥治療除了穩定病情外，在抗轉移方面優勢也較為明顯[4]。貓爪草屬毛茛科，性甘辛、溫平，具有解毒、化痰散結功效，對治療直腸癌、肝癌等腫瘤能夠起到積極效果[5]。冬凌草屬唇形科，性微寒，對治療肝癌、肺癌等有重要作用[6]。近年來，圍繞貓爪草與冬凌草的分析和研究增多，如成分分析、藥理分析等[7]。而在貓爪草與冬凌草抗癌作用機制及具體藥效物質基礎方面的研究卻很有限[8]。因此，運用網絡藥理學和分子對接技術對貓爪草與冬凌草的抗癌機制分析，可以為這兩種中藥的臨床應用研究提供一定的科學依據。

1 資料與方法

1.1 獲取中藥活性成分及作用靶點

在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）與傳統中藥百科全書（the encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM）數據庫中采集活性成分；在有機小分子生物活性數據庫（PubChem）中獲得化學結構式；在小分子藥物預測作用靶點平臺（Swiss Targe Prediction）中獲得作用靶點。

1.2 網絡構建“藥物-成分-作用靶點”

運用軟件Cytoscope 3.9.1 制作“藥物-成分-作用靶點”互作網絡圖，度值（Degree）的大小決定節點大小。

1.3 取藥物與疾病靶點交集

在Gene Card 數據庫中以“ hepatocellular carcinoma”為關鍵詞進行檢索相關疾病靶點，排除低關聯度靶點后獲得藥物靶點，在疾病靶點和藥物靶點中取交集靶點作為HCC 的潛在靶點。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡

將篩選后的潛在靶點導入到STRING 平臺，獲取PPI 網絡后做可視化處理。在PPI 網絡圖的構建中，度值決定節點大小，結合分數決定邊的粗細。

1.5 構建“藥物-成分-疾病靶點”網絡

運用Cytoscope 3.9.1 軟件制作“藥物-成分-疾病靶點”互作網絡圖，借助“網絡分析”功能獲得互作度值，明確藥物治療HCC 的重要成分及相互作用力度。

1.6 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

在數據庫Metascape 中，對獲取的基因進行KEGG 通路富集分析。

1.7 分子對接研究方法

從蛋白質結構數據庫（protein data bank，PDB）中下載蛋白靶標的晶體結構文件，通過軟件ChemDraw 繪制其化學成分結構，并在軟件Autodock 4.2.6 中將化合物與蛋白靶標虛擬對接。通過軟件PyMOL 2.2.0、DS2019 對對接模式圖進行可視化分析。

2 結果

2.1 活性成分的篩選

在數據庫TCMSP 中以生物利用度（oral bioavailability，OB）值≥30、類藥性（drug-likes，DL）值≥0.18 篩選出貓爪草活性化合物9 個，冬凌草23個。按貓爪草、冬凌草首拼音縮寫MZC1 ～MZC12、DLC1 ～DLC24 進行編號，活性化合物及參數信息見表1 ～2。

表1 貓爪草活性化合物及其參數信息

表2 冬凌草活性化合物及其參數信息

2.2 貓爪草與冬凌草活性成分-靶點網絡的構建

通過TCMSP 數據庫分析，總結出貓爪草、冬凌草藥物靶點蛋白分別有560、1257 個。靶點蛋白所對應的基因名稱通過蛋白質信息數據庫UniPort 獲得，剔除未獲取到基因名稱、非人源基因及重復出現的基因后得到貓爪草、冬凌草靶點蛋白分別有459、561 個，其中共同靶點蛋白有299 個，見圖1。

圖1 貓爪草與冬凌草的活性成分-靶點圖

2.3 構建貓爪草與冬凌草藥物靶點-肝癌靶點網絡

從數據庫Gene Card 與Drugbank 中分別獲得HCC 相關靶點4307 個和763 個，去除共有的42 個重復基因和靶點后，剩余4265 個和721 個，見圖2。

2.4 貓爪草與冬凌草活性成分靶點和肝癌靶點網絡數據圖

運用UnitProt 數據庫對靶點數據進行標準化，發現兩味藥與HCC 共有靶點26 個，其中貓爪草12 個、冬凌草14 個。運用軟件Cytoscope 3.9.1 建立所得的藥物活性成分及HCC 兩類靶點網絡數據圖，涉及節點721 個、邊數2483 條，見圖3。圖中節點的度值表現為與其他節點的連通性，與關鍵性成正比。

圖3 貓爪草與冬凌草活性成分靶點和癌癥靶點網絡圖

2.5 構建貓爪草與冬凌草作用肝癌靶點PPI網絡

將STRING 數據庫中獲取的制表符分隔值數據導入軟件CytoScope 3.9.1 中，構建PPI 網絡后進行拓撲分析。結果表明與其他靶點比較，病毒癌基因（sarcoma gene，SRC）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、信號傳導及轉錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT3）等基因的節點度值明顯更高，見圖4。

圖4 貓爪草與冬凌草作用肝癌靶點PPI 網絡

2.6 PPI靶點基因的KEGG通路

采取KEGG 通路對從Metascape 數據庫所得的共同靶點進行探究，獲得20 條信號通路網絡圖（圖5），“成分-靶點-通路”網絡圖（圖6）。從圖中可見通路和靶點之間有著密切聯系，其中以“癌癥的通路（pathways in cancer）”與“過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor，PPARA）”靶點的關系最為密切。

圖5 KEGG 通路富集化分析氣泡圖

圖6 “成分-靶點-通路”網絡圖

2.7 分子對接

將維生素肌醇、太白冬凌草素和谷甾醇葡萄糖苷等活性因子與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶蛋白Akt1（serine/threonine kinase 1，Akt1）交集靶點逐一進行對接，若分子對接的結合能<0 kJ/mol 表明靶點蛋白與化合物自然狀態下可自發結合。運用軟件PyMOL 2.4.0 和AutoDock 進行可視化對接，將對接結果繪制為三維圖，見圖7A ～C。由此可知，貓爪草與冬凌草在抑制癌細胞生長和繁殖方面具有積極作用，維生素肌醇、太白冬凌草素和谷甾醇葡萄糖苷等活性因子是產生影響的主要要素。

圖7 貓爪草與冬凌草活性成分與靶點蛋白對接三維圖

3 討論

利用TCMSP 數據庫檢索出32 個經確認的活性化合物，其中貓爪草9 個、冬凌草23 個。甾醇單葡萄糖苷和泰白魯貝森素A 分別是貓爪草和冬凌草中能夠進行相互作用最多的靶蛋白，意味著這兩種成分極有可能是貓爪草與冬凌草中能夠抑制癌細胞生長的主要成分。

PPI 網絡顯示，SRC、MAPK1、MAPK3 及STAT3 基因顯著高于其他靶點。這幾個靶點大概率就是貓爪草與冬凌草對HCC 細胞進行作用影響時所附著的主要靶點。細胞外的SRC 能夠激活SRC 蛋白的細胞質復合物蛋白，促進細胞的增殖與生長以及腫瘤的轉移、侵襲[9]。MAPK 信號通路對細胞的發育與分化以及生物的合成具有重要作用，將其應用于腫瘤治療中，能夠阻礙腫瘤細 胞的發展，加速腫瘤細胞的凋亡[10]。激活STAT3 通路，會促進腫瘤細胞的轉移、侵襲與生長，影響預后療效。而借助介導STAT3 通路則可以對癌細胞的凋亡與增殖產生影響[11]。

為了獲悉貓爪草與冬凌草治療HCC 的作用機制，本研究對所涉及到的交集靶點展開了KEGG 分析。結果顯示，細胞組分在大多數情況下都密集分布在膜筏、細胞體、膜微區等系列要素中，進而調控癌癥通路（pathways in cancer）、脂質和動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）和PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathwary）等，從而發揮出冬凌草和貓爪草對HCC細胞的抑制效用。癌癥通路可經生長因子、炎癥、細胞因子等細胞外刺激激活，不同亞家族激活后經磷酸化轉錄因子、細胞骨架相關蛋白和酶等多種底物相互調節來介導、傳遞有絲分裂原信號調節細胞的存活、增殖和分化，從而在癌癥的發生發展中起重要作用[12]。血漿脂蛋白含有不同量的脂質氧化產物，已知脂質氧化產物會損害正常生理功能并刺激動脈粥樣硬化過程。血漿脂蛋白是脂質氧化產物的活性載體，大量數據表明，脂蛋白脂質氧化產物轉運與動脈粥樣硬化的風險有關[13-14]。PI3K 這種細胞內的信號蛋白，具有催化活性的作用，能夠對下游的Akt 磷酸化水平進行有效調控，在兩者的協同作用下構建起了PI3K-Akt 信號通路，并對系列細胞遷移產生一定影響[15]。PI3K-Akt 信號通路會多方面地影響腫瘤細胞，使腫瘤細胞的發育受阻[16]，SRC、MAPK1、MAPK3 及STAT3 等關鍵靶點富集于此通路中。由此可見，貓爪草與冬凌草在HCC 治療中PI3K-Akt 信號通路發揮重要作用，這可能是貓爪草與冬凌草對HCC 有較好療效的分子機制。

本研究借助網絡藥理學與分子對接有關策略明確了貓爪草與冬凌草中潛在的有效成分如維生素肌醇、太白冬凌草素和谷甾醇葡萄糖苷等。這些成分作用于SRC、MAPK1、MAPK3 及STAT3 等多個靶點，并通過癌癥通路、PI3K-Akt 信號通路等參與外在激酶活性的調節、對激素的反應、平滑肌細胞增殖的調節等，進而發揮對HCC 的治療作用。由于中藥的口服使用在不同人體內的實際藥效并不相同，導致分析篩選出的活性成分和效果也不盡相同。因此，在今后的研究分析中還需進行深度的探討，以保證該結論的正確性和科學性。