一起金黃色葡萄球菌引起的學(xué)校食物中毒的流行病學(xué)調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室分析

王春旭 王彥文 黃程程 賀漓漓 韓丹丹 黃 輝

廣西壯族自治區(qū)桂林市疾病預(yù)防控制中心檢驗(yàn)科，廣西 桂林 541001

金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛存在，是引起細(xì)菌性食物中毒的主要致病菌之一，主要通過在食物中繁殖產(chǎn)生腸毒素引起腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐等主要胃腸道癥狀[1]。金黃色葡萄球菌是引起食源性細(xì)菌性疾病暴發(fā)的重要病原體之一。在美國，導(dǎo)致食物中毒的金黃色葡萄球菌僅次于大腸桿菌，占細(xì)菌性食物中毒的33%，位居細(xì)菌性食物中毒的第二位；在加拿大則更高，占細(xì)菌性食物中毒的45%[2]；在我國則是位居食物中毒事件的第三位[3-4]。

隨著抗生素在養(yǎng)殖場所、食品保鮮以及臨床的廣泛應(yīng)用，醫(yī)源性及食源性病原菌的耐藥性對食品安全和臨床治療的危害越來越受到重視。自耐甲氧西林金葡萄球菌在抗生素選擇壓力下出現(xiàn)以來，其多藥耐藥特點(diǎn)迅速成為全球性公共衛(wèi)生問題。研究表明，細(xì)菌對抗生素的耐藥性可通過環(huán)境和食物鏈傳播[5]。因此，了解食源性金黃色葡萄球菌的耐藥情況對食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估和臨床感染防控具有重要意義。

2021 年5 月28 日，廣西某市某中學(xué)發(fā)生一起以嘔吐、腹痛、腹瀉為主要癥狀的食物中毒，食物中毒人數(shù)共11 人。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，判定該事件為一起金黃色葡萄球菌污染引起的食物中毒事件。現(xiàn)對其流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 事件基本情況 2021 年5 月28 日上午10 ∶30開始，廣西某市某中學(xué)校醫(yī)室陸續(xù)有來自不同年級不同班級的學(xué)生因嘔吐、腹痛、腹瀉癥狀前來就診，至當(dāng)日16 ∶00，共計(jì)11 名學(xué)生就診。

1.1.2 患病學(xué)生就餐情況 患病學(xué)生早餐食用了在該校2 號小賣部購買由某餅家生產(chǎn)的“脆皮法棍泡芙”。“脆皮法棍泡芙”為糕點(diǎn)（冷藏類）（標(biāo)注生產(chǎn)日期：2021-05-28）。該小賣部共出售該商品34 份，罹患率為32.35%（11/34）。

1.2 方法

1.2.1 流行病學(xué)及現(xiàn)場衛(wèi)生學(xué)調(diào)查 采用描述流行病學(xué)方法對病例的臨床癥狀及三間分布特征進(jìn)行分析，通過現(xiàn)場查看餅屋環(huán)境，訪談該餅屋工作人員，分析可疑食品污染源及可能危險(xiǎn)因素。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)室檢測 樣本采集：共采集患病學(xué)生肛拭子7 份，學(xué)校小賣部食品“脆皮法棍泡芙”4 份，某餅屋從業(yè)人員肛拭子7 份、手部涂抹樣7 份，“脆皮法棍泡芙”（和學(xué)校食品非同一批次）1 份，外環(huán)境涂抹樣4 份。

主要試劑與儀器：金黃色葡萄球菌增菌液、分離培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱公司），金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（科瑪嘉，法國）、核酸提取試劑（江蘇碩世公司），核酸檢測試劑盒（深圳生科原公司），藥敏試劑（珠海迪爾公司），測序試劑（illunina 公司）。HH.B11.500 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)）、SSNP 全自動(dòng)核酸提取儀（江蘇碩世）、COBAS Z480 熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)（羅氏）、MALDI 全自動(dòng)微生物質(zhì)譜系統(tǒng)（法國布魯克）、全自動(dòng)微生物鑒定和藥敏分析儀（美國THERMO 公司）、Miseq 高通量基因測序系統(tǒng)（美國illunina 公司）。

熒光定量PCR 法檢測核酸：取200 μl 待檢樣品加入核酸提取試劑盒（磁珠法），進(jìn)行核酸提取；將提取好的樣品核酸提取液，分別用金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、諾如病毒核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法），按說明書設(shè)定循環(huán)參數(shù)進(jìn)行檢測。

金黃色葡萄球菌分離及鑒定：依據(jù)GB 4789.10-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[6]、WS/T 80-1996《葡萄球菌食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》[7]《WS 271-2007 感染性腹瀉診斷標(biāo)準(zhǔn)》[8]，對食品、患者及從業(yè)人員肛拭子、手涂抹樣本和外環(huán)境樣本，分別進(jìn)行金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)、分離和鑒定。

金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測：用金黃色葡萄球菌腸毒素（Staphylococcus aureusenterotoxin，SEs）核酸檢測試劑盒（熒光PCR 法），分別進(jìn)行腸毒素A、B、C、D、E 型的檢測，按照試劑說明書，樣本檢測結(jié)果ct 值≤36，有明顯的指數(shù)增長，則判為陽性。

全基因組測序：對1 株來源于食品泡芙的金黃色葡萄球菌和1 株來源于患者肛拭子的金黃色葡萄球菌，制作gDNA、標(biāo)記基因組DNA、擴(kuò)增文庫、純化文庫、文庫混合，制備上機(jī)文庫，用Miseq 高通量基因測序系統(tǒng)進(jìn)行全基因組測序，用華大制造微生物基因組分析軟件MGAP 進(jìn)行有參組裝拼接，進(jìn)入NCBI 官網(wǎng)，對兩株金黃色葡萄球菌的基因組序列進(jìn)行比對（Nucleotide Blast）。

藥物敏感性檢測：用金黃色葡萄球菌藥敏試劑板和細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（DL-96A），對分離得到的金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，采用15 種抗生素進(jìn)行檢測，用大腸埃希菌ATCC25922 作為質(zhì)量控制菌株，參照2020 年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行結(jié)果判定，抗菌藥物敏感性分為敏感（sensitivity，S）、中介（intermediary，I）和耐藥（resistance，R）。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征與體征

發(fā)病學(xué)生臨床癥狀與體征主要為惡心、腹痛（100%，11/11）、嘔吐（81.82%，9/11）、頭痛頭暈（45.45%，5/11）、腹瀉（≥3 次/24 h）（36.36%，4/11）、全身乏力（18.18%，2/11），見表1。腹瀉患者主要為水樣便，無黏液膿血便。

表1 某市某中學(xué)食物中毒病例臨床癥狀與體征分布（n=11）

2.2 流行病學(xué)特征

2.2.1 時(shí)間分布 第1 例病例于5 月28 日8 ∶30發(fā)病，最后1 例病例于5 月28 日11 ∶00 發(fā)病，發(fā)病高峰為5 月28 日10 ∶00，流行曲線顯示為點(diǎn)源暴露模式（圖1）。首末發(fā)病時(shí)間間隔（平均潛伏期）為2.5 h，發(fā)病時(shí)間平均數(shù)/中位數(shù)在10 ∶00，估計(jì)可能的暴露時(shí)間為7 ∶30 左右，可疑餐次為5 月28 日的早餐。

圖1 某市某中學(xué)食物中毒發(fā)病時(shí)間分布

2.2.2 班級和人群分布 11 例病例分布在初二、初三、高二和高三，其中初二6 例、高三3 例、初三和高二各1 例；剩余年級均無人發(fā)病。患者年齡13 ～18 歲；男生8 例，女生3 例（表2）。

表2 某市某中學(xué)食物中毒病例人群分布特征（n=11）

2.3 餅家現(xiàn)場衛(wèi)生學(xué)調(diào)查結(jié)果

該店有8 名從業(yè)人員，“脆皮法棍泡芙”生產(chǎn)場所為該店收銀臺的后面通道及裱花間：后面通道為烤制及泡芙醬配置場所，裱花間為擠泡芙醬場所。餅家老板自述當(dāng)天批次脆皮法棍泡芙共出品50 個(gè)，于5 月28日凌晨使用普通面包車運(yùn)送至該市某食品公司，食品公司使用面包車于5 ∶30 開始運(yùn)往某學(xué)校，6 ∶10 送至該學(xué)校某小賣部，小賣部6 ∶40 左右開始售賣。該批脆皮法棍泡芙在貯存、運(yùn)輸、售賣過程中，均沒有使用冷藏設(shè)備進(jìn)行冷藏，不符合《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)糕點(diǎn)、面包衛(wèi)生規(guī)范》（GB 8957-2016）[10]中，對有溫度控制要求的食品，其貯存運(yùn)輸和銷售應(yīng)冷藏保存的要求。

2.4 實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果

2.4.1 微生物學(xué)檢測結(jié)果 熒光定量PCR 法檢測結(jié)果顯示，諾如病毒和蠟樣芽孢桿菌核酸均為陰性，金黃色葡萄球菌核酸陽性13 份。見表3。

表3 某市某中學(xué)食物中毒樣品標(biāo)本檢測結(jié)果

對30 份樣品進(jìn)行金黃色葡萄球菌分離培養(yǎng)，共13 份樣本分離培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌，與PCR 結(jié)果完全符合。

2.4.2 金黃色葡萄球菌腸毒素檢測結(jié)果 對7 株來源于患者肛拭子、2 株來源于從業(yè)人員肛拭子、4 株來源于食品的金黃色葡萄球菌，分別進(jìn)行腸毒素A ～E 型的檢測，結(jié)果顯示，13 份樣本均檢測出金黃色葡萄球菌腸毒素A 型，金黃色葡萄球菌B、C、D、E 型均為陰性。

2.4.3 全基因組測序結(jié)果 對來源于食品泡芙樣本和來源于患者肛拭子的金黃色葡萄球菌基因組序列進(jìn)行比對，2 株金黃色葡萄球菌的序列一致性為99.44%，序列高度一致，E-value 值<1e-5。結(jié)果提示2 株金黃色葡萄球菌具有同源性。見圖2。

圖2 食品泡芙樣品與患者肛拭子樣本基因序列比對結(jié)果

2.4.4 藥物敏感性檢測結(jié)果 藥物敏感性檢測結(jié)果顯示，分離出的13株菌均對青霉素耐藥（耐藥率100%）；對苯唑西林、四環(huán)素、萬古霉素、紅霉素、慶大霉素、克林霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、替考拉寧、利福平、達(dá)托霉素、復(fù)方新諾明、頭孢西丁、呋喃妥因等14種抗生素敏感（敏感度100%）。

3 討論

金黃色葡萄球菌隸屬于葡萄球菌屬，是革蘭氏陽性菌，對營養(yǎng)需要量低，適宜生長溫度為37℃，對不良環(huán)境抵抗力較強(qiáng)，因此能存活在各種惡劣環(huán)境中。它屬于一種人畜共患病原體，人和動(dòng)物都有很高的帶菌率。據(jù)估計(jì)，該病原菌的攜帶者高達(dá)30%～80%[11]，且1/3 ～2/3 的攜帶者含有產(chǎn)腸毒素的菌株[12]，在金黃色葡萄球菌及其腸毒素食物中毒中，腸毒素超抗原家族成員占95%[13]。據(jù)報(bào)道，葡萄球菌腸毒素18 μg/100 g 食物即可致食物中毒[14]。

毒素和侵襲性酶是金黃色葡萄球菌的主要致病因子，包括SEs、血漿凝固酶、透明質(zhì)酸酶、血溶血素、剝脫毒素等[15]。其中，SEs 是金黃色葡萄球菌群分泌的具有超抗原活性的細(xì)菌毒素，臨床上金黃色葡萄球菌食物中毒大多數(shù)由A ～E 型腸毒素引起[12]。而攜帶A型腸毒素金黃色葡萄球菌是主要流行株[16]。本起食物中毒事件，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測也顯示為A 型腸毒素。

富含淀粉、高蛋白、水分較多的食物是金黃色葡萄球菌的良好培養(yǎng)基，如肉類、牛奶及制品、剩菜剩飯等是引起中毒的主要食品。在我國華東和華南地區(qū)引起金黃色葡萄球菌食物中毒的主要食品為糕點(diǎn)類食品和米面食品，且主要是由于在加工時(shí)污染致病因子且存儲不當(dāng)而引發(fā)[2]。在本起食物中毒事件中，經(jīng)衛(wèi)生學(xué)調(diào)查與實(shí)驗(yàn)室檢測也提示是由該餅家從業(yè)人員攜帶產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌，在制作“脆皮法棍泡芙”過程中污染食物，“脆皮法棍泡芙”存儲不當(dāng)而引起。因?yàn)樵陲炍萃猸h(huán)境、餅屋另一批次的“脆皮法棍泡芙”中未檢出金黃色葡萄球菌，但在2 名從業(yè)人員和小賣部剩余的“脆皮法棍泡芙”中檢測出與患者肛拭子樣本一致的金黃色葡萄球菌和A 型腸毒素，且在全基因組測序檢測中，也發(fā)現(xiàn)來源于泡芙的金黃色葡萄球菌和來源于患者肛拭子樣本的金黃色葡萄球菌，基因序列高度一致，提示具有同源性。

金葡菌腸毒素引起的食物中毒，臨床主要表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉，嚴(yán)重者可導(dǎo)致休克；發(fā)病急，潛伏期短，平均潛伏期2 ～4 h，一般為1 ～6 h，這與本起食物中毒事件中學(xué)生的發(fā)病潛伏期、臨床癥狀、體征基本相符。金黃色葡萄球菌腸毒素具有熱穩(wěn)定性，在100℃環(huán)境中加熱30 min 后仍能發(fā)揮作用，且不易被胃蛋白酶所破壞。產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌在20℃以上作用8 ～10 h 后可產(chǎn)生大量SEs。因此，被產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌污染的食物，經(jīng)過烹調(diào)后仍可引起食物中毒[12]。因此，為了更好且有效地預(yù)防金黃色葡萄球菌食物中毒的發(fā)生，需要對相關(guān)食物特別是米面食與糕點(diǎn)類通過冷藏保存、降低水活度等措施可抑制金黃色葡萄球菌的生長及其腸毒素的分泌[17]。

臨床治療金黃色葡萄球菌感染常使用青霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素、四環(huán)素等抗生素。但隨著廣譜抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的廣泛應(yīng)用，食源性金黃色葡萄球菌的耐藥性呈上升趨勢，甚至出現(xiàn)多重耐藥菌[18]。本起食物中毒事件中分離的金黃色葡萄球菌菌株均對青霉素耐藥，與上海市浦東新區(qū)[19]、深圳[20]、海南[21]等地情況類似。本檢測結(jié)果提示在臨床上對金黃色葡萄球菌食物中毒進(jìn)行治療時(shí)，使用青霉素?zé)o效果，要使用其他抗生素；同時(shí)也提示在養(yǎng)殖過程中在食品飼料中添加抗生素需要謹(jǐn)慎，因?yàn)閷κ吃葱圆≡w的耐藥性是由于長期在養(yǎng)殖飼料中添加抗生素作為預(yù)防措施而引起的[16]。

綜上所述，本次食物中毒事件是由該餅家從業(yè)人員攜帶產(chǎn)腸毒素的金黃色葡萄球菌，在制作“脆皮法棍泡芙”過程中污染食物，且食物存儲不當(dāng)而引起的A 型腸毒素食物中毒，菌株對青霉素耐藥。需加強(qiáng)對食品生產(chǎn)、運(yùn)輸、售賣環(huán)節(jié)監(jiān)管，保證食品安全，以便更有效地防止類似食物中毒的發(fā)生，同時(shí)謹(jǐn)慎使用抗生素。