礦泉水中銅綠假單胞菌檢測能力的驗證與分析

王同智　朱文斌　張洪偉　李俊霞　周浩

摘 要：通過參加外單位組織的礦泉水中銅綠假單胞菌檢測能力驗證，探索減少過濾后菌落數的計數方式和范圍，提高實驗室應用GB 8538—2022進行檢測的能力，同時驗證MALDI-TOF MS的準確性。依據組織方的作業指導書對樣品進行處理，采取25 mL+225 mL的方式進行稀釋，根據GB 8538—2022進行檢測，同時應用MALDI-TOF MS進行鑒定。樣品23-V717、23-H802報告結果的評價Z值分別為-0.1、-0.9，皆為滿意。此方式提高了實驗員檢測水平，驗證了借助基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）鑒定的準確性，縮短了檢驗檢測時間。

關鍵詞：基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS）；銅綠假單胞菌；檢測能力；準確性

Validation and Analysis of Detection Capability of Pseudomonas aeruginosa in Mineral Water

WANG Tongzhi1，2，3， ZHU Wenbin1，2，3， ZHANG Hongwei1，2，3， LI Junxia1，2，3， ZHOU Hao1，2，3*

（1.Chengdu Institute of Food Inspection， Chengdu 611130， China; 2.Key Laboratory of Chemical Metrology and Applications on Nutrition and Health for State Market Regulation， Beijing 100029， China;

3.Irradiation Preservation Key Laboratory of Sichuan Province， Chengdu 611130， China）

Abstract： By participating in the validation of the detection ability of Pseudomonas aeruginosa in mineral water organized by external units， exploring the counting method and range of reducing the number of colonies after filtration， and improving the laboratorys ability to apply GB 8538—2022 for detection， while verifying the accuracy of MALDI-TOF MS. Processing the samples according to the capability verification work instruction， were diluted by

25 mL+225 mL， and detecting in parallel according to GB 8538—2022， and identified by MALDI-TOF MS. The Z values of 23-V717 and 23-H802 were -0.1 and -0.9 respectively. The result is satisfactory. This capability validation improved the laboratory detection capability， verified the accuracy of MALDI-TOF MS identification， and shortened the testing time.

Keywords： matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS）; Pseudomonas aeruginosa; detection ability; accuracy

銅綠假單胞菌（簡稱銅綠）是一種常見的水源性條件致病菌，存在于各類型水中，可通過水源、土壤、工器具、接觸等多種方式進行傳播，對消毒劑、干燥、紫外等理化因素及不良環境具有很強的抵抗力[1]。銅綠假單胞菌可產生胞外酶、內毒素等數十種致病因子[2]，是容易致人產生急性腸道疾病和皮膚炎癥的致病菌[3]。對長期大量使用抗生素、大面積燒傷、機體免疫功能低下者，銅綠假單胞菌會引起皮膚黏膜感染、肺炎、腦膜炎、敗血癥等疾病[4-13]。大量的研究文獻指出飲用水中銅綠假單胞菌的檢出率比較高[4-13]，所以客觀地計數水中銅綠假單胞菌就相當重要。

能力驗證是參加實驗室間比對來提高實驗檢測能力的重要手段，是實驗室質量控制的重要方

式[14-20]。為了提高實驗室的檢測能力，2023年，實驗室參加了由中國檢科院測試評價中心組織的ACAS-PT1626（2023）礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測能力驗證，應用《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538—2022）進行檢測，同時借助基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）進行鑒定。日常實驗中按照GB 8538—2022的方法，濾膜上有很多菌落生長，對計數和挑取目標菌落都容易形成干擾。本次實驗驗證了MALDI-TOF MS的準確性，試驗過程中所涉及的過濾方式﹑計數原則同樣適用于日常檢驗檢測，既可以準確計數，也能縮短檢驗檢測時間。

1 材料與方法

1.1 樣品與對照菌株

樣品由中國檢科院測試評價中心提供（編號為23-V717、23-H802），陽性菌株選用銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和陰性菌株熒光假單胞菌（ATCC 13525）。

1.2 試劑

銅綠假單胞菌瓊脂基礎培養基（CN）瓊脂、營養瓊脂、綠膿菌素測定培養基（北京陸橋）；無菌親水性微孔濾膜（Millipore）：直徑47 mm，孔徑為0.45 μｍ；濾杯（Millipore）。

1.3 儀器

生化培養箱（Panasonic），Millipore六聯過濾系統，紫外檢測箱（上海嘉鵬科技有限公司）；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（Bruker Daltonik GmbH）。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

依據組織方提供的參試指導書進行樣品處理，在生物安全柜中打開樣品瓶，移入10 mL滅菌水進行復溶，復溶后倒入干燥的裝有玻璃珠的1 000 mL滅菌三角瓶中，用1 mL槍頭吸取殘留的懸液，再加入10 mL滅菌水清洗樣品瓶，最后用100 mL大肚吸管移取滅菌水到三角瓶中，每次移取時都加入一部分到樣品瓶中進行清洗，直至三角瓶中菌懸液總量為520 mL。三角瓶中的520 mL菌懸液即為樣品液。

1.4.2 樣品的稀釋

基于GB 8538—2022 以CFU/250 mL計，對樣品進行稀釋：吸取25 mL樣品液+225 mL滅菌水視為1∶10樣品液；吸取25 mL 1∶10樣品液+225 mL滅菌水視為1∶100樣品液，吸取25 mL 1∶100樣品液+225 mL滅菌水視為1∶1 000樣品液。

1.4.3 樣品過濾與培養

本次實驗采取兩種方式對樣品進行過濾，且每一稀釋度進行兩次過濾。方式一：對樣品稀釋后的250 mL樣品液進行過濾，過濾完后用滅菌水沖洗內壁。方式二：分別取樣品液（原液）250 mL、25 mL、2.5 mL、0.25 mL進行過濾，過濾后用滅菌水多次沖洗內壁。截留完成后的濾膜貼在CN瓊脂培養基上（注意瓊脂與濾膜之間不能有空隙），將貼好濾膜的CN瓊脂培養基倒置放入35～37 ℃的培養箱中培養，從24 h開始觀察計數直至48 h。

1.4.4 生化鑒定

依據GB 8538—2022對目標菌落進行生化試驗，同時采用MALDI-TOF MS對菌落進行鑒定。

2 結果與分析

2.1 本次能力驗證

通過兩種方式過濾，培養后CN瓊脂平皿上有兩種可疑菌落形態，一種呈綠色且紫外線觀察有熒光產生，計數見表1。另外一種呈淡綠色菌落且紫外線觀察無熒光產生，計數見表2。綠色菌落較淡綠色菌落大，淡綠色菌落數比綠色菌落數多。

從表1與表2可知，同一稀釋度方式一結果普遍比方式二結果大，說明方式一的菌落更分散；計數24 h大于48 h的結果，可能是隨著培養時間的延長，菌落變大出現融合現象。

2.2 可疑菌落的確證

按照GB 8538—2022確證試驗的步驟，分別挑取不同稀釋度兩種菌落形態各10個（不足10個則全挑）劃線接種營養瓊脂36 ℃培養24 h后，進行綠膿菌數試驗，同時按照《出口食品中病原微生物快速篩選方法 MALDI-TOF MS法 第9部分：銅綠假單胞菌》（SN/T 5228.9—2019）進行鑒定。同一菌落形態的10個菌落鑒定結果一致，且匹配分值均大于2.3（根據MALDI-TOF MS對于鑒定的規則，確定匹配分值大于2.3表示可信度很高），鑒定結果見表3。對于MALDI-TOF MS鑒定為可疑金黃色葡萄球菌的淡綠色菌落，再次按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）進行復核，復核結果確認為金黃色葡萄球菌。本次試驗中MALDI-TOF MS法與常規生化（GB 8538—2022）的鑒定結果一致，且較常規鑒定更方便快捷，為檢驗檢測提供多種選擇。

2.3 計數與報告結果

參考GB 4789.10—2016的計數規則，選取菌落數在20～200的稀釋度進行計數，方式一與方式二兩種稀釋方式計數結果見表4。按照GB 8538—2022中57.5.3 結果觀察與計數的要求，本次能力驗證報告結果選用方式一的24 h結果進行報送，組織單位根據本實驗報送的結果計算的Z值見表5。組織單位返回的Z值說明本次試驗結果偏低于中位值，菌落分散不夠或者是菌落相互融合計數偏低。

3 結論與討論

這次能力驗證需要進行稀釋，以減少濾膜上菌落數，實現準確計數，而GB 8538—2022中沒有稀釋過程，且沒有要求進行多次過濾。減少濾膜上的菌落數有兩種途徑，稀釋后過濾和減少過濾量，本次試驗稀釋后過濾比減少過濾量結果好，但需要更多試驗驗證。GB 8538—2022中沒有選取濾膜的計數范圍。目前GB 4789系列標準中，常見直徑為90 mm培養皿計數范圍有10～100 CFU[21]﹑10～150 CFU[22]﹑15～150 CFU[23-24]﹑20～200 CFU[25-26]﹑30～300 CFU[27-28]。選擇不同的計數范圍直接影響稀釋度的選擇，從而影響報告結果。GB 8538—2022要求的濾膜直徑為47 mm，相比直徑為90 mm培養皿則小得多，不利于菌落在濾膜上分散，容易導致菌落聚集融合，因此選擇合適的計數范圍則尤為重要，這直接影響計數結果。計數范圍的選擇應充分考慮計數面積和菌落生長的情況。

參考文獻

[1]聞玉梅.現代醫學微生物學[M].上海：上海醫科大學出版社，1999.

[2]魏光，葉英，沈繼錄.2009—2012年銅綠假單胞菌耐藥性分析[J]中華醫院感染學雜志，2013，23（24）：6115-6117.

[3]王莉，李明，江志紅，等.543株銅綠假單胞菌的臨床分布及耐藥性[J].解放軍預防醫學雜志，2017，35（4）：355-356.

[4]陳松，李紅，李德華，等.桶裝飲用水中銅綠假單胞菌污染情況分析[J].現代預防醫學，2015，42（6）：1129-1130.

[5]王燕梅，唐震，喬昕，等.江蘇省桶裝飲用水中銅綠假單胞菌污染情況調查[J].中國衛生檢驗雜志，2015，25（12）：2019-2020.

[6]魏磊，吳清平，張菊梅，等.礦泉水和山泉水中銅綠假單胞菌污染調查及分離菌株毒力基因與耐藥性分析[J].微生物學通報，2015，42（1）：125-132.

[7]李莉，朱曉露，馬會會.桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測分析[J].中國衛生檢驗雜志，2016，26（3）：409-410.

[8]段江麗，胡汝源，楊紅菊.大理州市售食品細菌性污染情況分析[J].中國衛生檢驗雜志，2017，27（6）：869-871.

[9]周臣清，張娟，黃寶瑩，等.廣州市售瓶（桶）裝水中銅綠假單胞菌污染現狀及其耐藥現象研究[J].中國釀造，2017，36（12）：168-171.

[10]劉思超，徐勵琴，羅澤燕，等.223份桶裝天然礦泉水和包裝飲用水中銅綠假單胞菌的檢測結果分析[J].預防醫學情報雜志，2016，32（10）：1071-1075.

[11]郭遼樸，仁蘊慧，牛世文.2013—2014年漯河市桶裝飲用水中銅綠假單胞菌污染狀況調查[J].中國衛生工程學，2017，16（1）：33-35.

[12]苗楊.2014年—2015年沈陽市康平縣桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染監測分析[J]. 航空航天醫學雜志，2016，27（10）：1286-1288.

[13]曾曉琮，汪廷彩，周露，等.2015年廣東省桶裝飲用水中銅綠假單胞菌的污染調查和藥敏性分析[J].食品安全質量檢測學報，2018，9（12）：2965-2969.

[14]中國合格評定國家認可委員會.能力驗證規則：CNAS-RL02：2018[S/OL].（2018-03-01）[2023-12-05].http：//www.doc88.com/p-97939053609307.html.

[15]王立平，蔡雪鳳.微生物實驗室參加FEPAS能力驗證計劃的質量控制及對策[J].食品科技，2011，36（7）：256-260.

[16]吉彥莉，郭勇峰，王敬輝，等.食品微生物學檢測能力驗證分析[J].公共衛生與預防醫學，2015，26（3）：110-112.

[17]賈東，李宏，王金玲，等.食品微生物學能力驗證過程質量控制的研究[J].現代測量與實驗室管理，2012，20（6）：49-52.

[18]汪桃花，代真真，王新文，等.能力驗證對提升實驗室技術水平的影響[J].現代食品，2018（16）：19-22.

[19]張洪偉，周浩，朱文斌，等.銅綠假單胞菌檢測能力驗證結果與分析[J].食品質量安全檢測學報，2019，10（6）：1722-1725.

[20]肖劍，李惠琴，陳楷，等.食品微生物能力驗證樣品菌落總數檢驗方法[J].食品質量安全檢測學報.2014，5（10）：3343-3348.

[21]中華人民共和國衛生部.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸埃希氏菌計數：GB 4789.38—2012[S].北京：中國標準出版社，2012.

[22]國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數：GB 4789.15—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[23]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數：GB 4789.3—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[24]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗：GB 4789.30—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[25]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗：GB 4789.10—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[26]國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗：GB 4789.14—2014[S].北京：中國標準出版社，2014.

[27]國家衛生健康委員會，國家市場監督管理總局.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定：

GB 4789.2—2022[S].北京：中國標準出版社，2022.

[28]國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗：GB 4789.35—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

作者簡介：王同智（1993—），男，甘肅白銀人，本科，工程師。研究方向：食品安全檢測。

通信作者：周浩（1982—），男，四川達州人，碩士，高級工程師。研究方向：食品安全檢測。E-mail：402241344@qq.com。