水產品中組胺快速檢測的方法研究

汪開銀　熊麗莎　陳斌　黃丹萍　聶小林　熊曉輝

摘 要：目的：建立水產品中組胺快速檢測的方法，并進行方法學驗證。方法：本研究以偶氮試劑法-比色卡法作為水產品中組胺的快速檢測手段。樣品中的組胺經提取后，通過正戊醇萃取凈化，再與偶氮試劑反應生成橙色化合物，其溶液顏色的深淺在一定范圍內與樣品中組胺的含量呈正相關，通過組胺標準色階卡進行目視比色，對樣品中組胺進行定性判定。結果：以鱸魚、秋刀魚、羅氏蝦作為空白基質的檢出限為200 mg·kg-1，靈敏度和特異性為100%、假陰性率和假陽性率為0%。結論：該方法快速準確，靈敏度高，適用于水產品中組胺的快速檢測。

關鍵詞：組胺；水產品；方法學驗證；快速檢測

Research on Rapid Detection of Histamine in Aquatic Products

WANG Kaiyin1， XIONG Lisha2*， CHEN Bin1， HUANG Danping1， NIE Xiaolin1， XIONG Xiaohui3

（1.National Light Industry Food Quality Supervision and Inspection in Nanjing， Nanjing 211800， China; 2.Jiangsu Association for Food Production Safety， Nanjing 211816， China; 3.Nanjing Tech University， Nanjing 211800， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid method for detecting histamine in aquatic products and validate it through methodological validation. Method： This study used the azo reagent colorimetric card method as a rapid detection method for histamine in aquatic products. After extraction， histamine in the sample is purified by n-pentanol extraction， and then reacts with azo reagents to generate orange compounds. The color depth of the solution is positively correlated with the content of histamine in the sample within a certain range. The histamine in the sample is qualitatively determined by visual colorimetry using the histamine standard color scale card. Result： The detection limit using sea bass， saury， and shrimp as blank matrices was 200 mg·kg-1， with a sensitivity and specificity of 100% and a false negative and false positive rate of 0%. Conclusion： This method is fast， accurate， highly sensitive， and suitable for the rapid detection of histamine in aquatic products.

Keywords： histamine; aquatic products; methodological validation; rapid detection

組胺是一種生物堿，廣泛存在于動植物體內。水產品中的組胺是機體在腐敗過程中由組氨酸在脫羧酶的作用下產生的[1-5]。所以，水產品尤其是一些青皮紅肉魚類，如秋刀魚、沙丁油魚、鰹魚和金槍魚等，長時間放置或發生腐敗都容易產生組胺。組胺是所有生物胺中對人體健康影響最大的物質，過量攝入會導致頭痛、頭暈、心跳加快、皮膚瘙癢、呼吸困難等癥狀，甚至可能引起過敏性食物中毒[6-9]。所以，組胺是評價水產品特別是青皮紅肉魚類質量的重要指標，并且可以根據魚肉中組胺含量，監測水產品在生產和運輸過程中的質量變化。有關水產品的國家標準規定，高組胺魚類及制品中組胺含量不得高于40 mg/100 g，其他海水魚類及制品中組胺含量不得高于20 mg/100 g[10-12]。

目前，水產品中組胺檢測方法主要有高效液相色譜法、比色卡法、分光光度法、膠體金免疫層析法、酶聯免疫法、生物化學法、生物酶法及薄層層析法等[13-19]。比色卡法和分光光度法的應用相對廣泛。分光光度法檢測結果可由分光光度計直接讀取，直觀準確，但是需要使用分光光度計。比色卡法更適合作為快速檢測水產品中組胺的方法，檢測結果可由目視比色直觀得到，但是比色卡法得到的結果容易受到干擾，需要不斷改進[20-22]。《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》（GB 5009.208—2016）是檢測水產品中組胺的標準方法。本文參照GB 5009.208—2016中第二法分光光度法，擬定偶氮試劑法-比色卡法測定組胺的實驗步驟。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱸魚、秋刀魚、羅氏蝦均購自超市，經GB 5009.208—2016第一法液相色譜法測試，本底不含組胺。

三氯乙酸（C2HCl3O2）、氫氧化鈉（NaOH）、正戊醇（C5H12O）、鹽酸（HCl，37%）、碳酸鈉（Na2CO3）、對硝基苯胺（C6H6N2O2）、亞硝酸鈉（NaNO2），均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；組胺、色胺、腐胺、β-苯乙胺、尸胺、精胺、章魚胺、亞精胺、酪胺標準品（濃度為1 mg·mL-1），上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.2 儀器設備

移液器，Eppendorf；Vortex QL-866渦旋混合器，廈門市其林貝爾儀器制造有限公司；BSA224S萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；HH-6數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司。

1.3 實驗方法

樣品中的組胺經提取后，通過正戊醇萃取凈化，與偶氮試劑反應生成橙色化合物，其溶液顏色的深淺在一定范圍內與樣品中組胺的含量呈正相關，通過組胺標準色階卡進行目視比色，對樣品中組胺進行定性判定。

1.3.1 試樣制備

去頭、骨、內臟、魚皮、蝦頭等，取肌肉組織部分，用組織勻漿機充分粉碎混勻，裝入密封袋中密封，做好標記，試樣貯藏于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.2 試樣提取與測定

準確稱取上述制備好的試樣（2±0.02）g，置于15 mL的離心管中，加5 mL三氯乙酸溶液，搖勻后，渦旋2 min，于4 000 r·min-1下離心3 min。吸取上清液0.5 mL置于10 mL的離心管中，加入0.2 mL氫氧化鈉溶液，再加入2 mL正戊醇，渦旋3 min，于4 000 r·min-1下離心1 min。取上清液0.5 mL于10 mL離心管中，加入2 mL鹽酸溶液，渦旋3 min，于4 000 r·min-1下離心1 min。取下層液作為提取液。

準確吸取上述提取液0.5 mL置于5 mL離心管中，加入0.75 mL碳酸鈉溶液搖勻，再加入0.75 mL偶氮試劑混勻，放置10 min。與組胺標準色階卡目視比色，10 min內判讀結果。

1.3.3 結果判定

觀察待測液的顏色，與標準色階卡比較判讀樣品中組胺的含量。顏色淺于檢出限（200 mg·kg-1）則為陰性樣品；顏色接近或者深于檢出限（200 mg·kg-1）則為陽性樣品。用組胺標準溶液配制成濃度系列為0 mg·kg-1、200 mg·kg-1、300 mg·kg-1、400 mg·kg-1、500 mg·kg-1、600 mg·kg-1、800 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1組胺標準比色卡，見圖1。

從左到右濃度梯度0～1 000 mg·kg-1逐漸增大。

1.3.4 實驗方法學研究

（1）快檢產品性能指標的測定。以鱸魚、秋刀魚和羅氏蝦作為空白基質樣品，添加組胺標準溶液，得到濃度分別為0 mg·kg-1（空白）、100 mg·kg-1（0.5倍LOD）、200 mg·kg-1（1倍LOD）、400 mg·kg-1（2倍LOD）的盲樣各50份（0 mg·kg-1和100 mg·kg-1為陰性樣品；200 mg·kg-1和400 mg·kg-1為陽性樣品，以下相同），按實驗步驟進行測定。

（2）交叉反應。以秋刀魚作為空白基質樣品，分別加入色胺、腐胺、β-苯乙胺、尸胺、精胺、章魚胺、亞精胺、酪胺等標準溶液，得到濃度分別為10 mg·kg-1、20 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1、200 mg·kg-1、400 mg·kg-1、600 mg·kg-1、800 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1、1 500 mg·kg-1、2 000 mg·kg-1、2 500 mg·kg-1的系列樣品，按實驗步驟進行測定，考察組胺與上述化合物的交叉反應。交叉反應率的計算公式為交叉反應率=（組胺最低檢出限/其他物質最低

檢出限）×100%（1）

（3）與參比方法一致性。以鱸魚、秋刀魚和羅氏蝦作為空白基質樣品，添加組胺標準溶液，制備成添加濃度為200 mg·kg-1的盲樣樣品各50份，按實驗步驟進行測定。以現行國家標準GB 5009.208—2016第一法液相色譜法作為參比方法，對方法一致性進行研究。

（4）方法學驗證。根據食藥監科便函[2017]43號《食品快速檢測方法評價技術規范》方法驗證要求，南京工業大學（國家輕工業食品質量監督檢測南京站，以下簡稱南京站）聯絡和組織了廈門市食品藥品質量檢驗研究院（以下簡稱廈門院）、江蘇省食品藥品監督檢驗研究院（以下簡稱省食藥）、江蘇省產品質量監督檢驗研究院（以下簡稱省質檢）、江蘇省理化測試中心（以下簡稱省理化）、南京市產品質量監督檢驗院（以下簡稱市質檢）5家方法驗證單位，分別對水產品中組胺快速檢測方法進行了方法學驗證。選用鱸魚、秋刀魚和羅氏蝦作為空白基質樣品，添加組胺標準溶液，分別制備成濃度為0 mg·kg-1（空白）、100 mg·kg-1（0.5倍LOD）、200 mg·kg-1（1倍LOD）、400 mg·kg-1（2倍LOD）4個添加水平的盲樣，每個添加水平各制備300份，總共制備3 600份，以盲樣形式寄送給上述單位，按照實驗步驟進行測定。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇與優化

參照GB 5009.208—2016第二法分光光度法，擬定偶氮試劑法-比色卡法測定組胺的步驟。

2.1.1 提取液三氯乙酸加入量的優化

準確稱取制備好的試樣（2±0.02）g，置于15 mL的離心管中，加入0.8 mL組胺標準溶液（1 mg·mL-1）使樣品加標量為400 mg·kg-1，加入一定體積的三氯乙酸溶液，按此快速檢測方法測定，觀察顏色并測定吸光度，根據標準曲線計算不同加入量的回收率。樣品中分別加入三氯乙酸溶液2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、8 mL、10 mL，測定的稀釋液吸光值分別為0.409、0.372、0.346、0.229、0.264、0.200，對應的加標回收率為68%、76%、80%、96%、80%、71%。

提取液三氯乙酸加入量和顏色變化見圖2。從圖2和加標回收率可以看出，當提取液三氯乙酸溶液的加入量為5 mL時，顏色反應相對適中，且回收率也比較高，因此，選取5 mL作為三氯乙酸提取溶液的加入量。

2.1.2 氫氧化鈉溶液加入量對pH值的影響

由于酸堿性條件對萃取效果的影響不同，在樣品經三氯乙酸提取后，用正戊醇提取前，必須使樣液呈堿性，才能使組胺游離出來，便于提取。

GB 5009.268—2016分光光度法選用250 g·L-1 NaOH調節pH值在10～12。考察NaOH加入量對實驗結果的影響，結果發現，只有在加入量大于0.05 mL時才能滿足pH值＞10，因此研究0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL的加入量對回收率的影響，結果見表1。從表1中可以看出，當氫氧化鈉溶液加入量為0.2 mL時，回收率達到98.1%，更接近100%。因此，選取0.2 mL作為氫氧化鈉溶液的最佳加入量。

2.1.3 萃取過程正戊醇加入量的優化

在樣品中加入0.8 mL組胺標準溶液（1 000 μg·mL-1）使樣品加標量為400 mg·kg-1，按快檢方法的操作步驟，觀察正戊醇加入量對凈化萃取樣液中組胺效果的影響。正戊醇加入量對萃取效果的影響見表2，樣液萃取效果見圖3。從表2和圖3可以看出，當加入正戊醇2 mL時，樣液顏色最深，萃取效果最佳，同時回收率也是最高，達到97.3%。因此，選取2 mL作為萃取液正戊醇的加入量。

2.1.4 反萃取過程鹽酸加入量的優化

反萃取過程中加入鹽酸主要是使溶液呈酸性，與組胺生成組胺鹽酸鹽而轉至鹽酸提取液中，所以鹽酸溶液的加入量影響組胺的反萃取效果。制備加標量為400 mg·kg-1的樣品，按快檢方法的操作步驟，觀察鹽酸溶液加入量對反萃取效果的影響并測定吸光度，計算樣品加標回收率。鹽酸溶液加入量為1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL時，吸光值及回收率見表3，反萃取效果見圖4。從表3和圖4可以看出，當加入鹽酸溶液2 mL時，樣液顏色最深，反萃取效果最佳，同時回收率也是最高，達到91.4%。因此，選取2 mL作為反萃取液鹽酸的加入量。

2.1.5 偶氮反應pH值的影響

組胺與重氮鹽偶氮反應應在弱堿環境下完成。GB 5009.268—2016分光光度法中采用2 mL提取液+3 mL 50 g·L-1碳酸鈉+3 mL偶氮試劑進行反應，等比例采用0.5 mL提取液+0.75 mL 50 g·L-1碳酸鈉+0.75 mL偶氮試劑時發現顯色反應不明顯，究其原因主要是pH值的影響，見表4。當碳酸鈉濃度為50 g·L-1時，pH值約7.0，提高到100 g·L-1以上，pH值才能滿足反應的要求。實驗比較了100 g·L-1、150 g·L-1碳酸鈉濃度對pH值的影響，發現在同樣條件下，100 g·L-1濃度下的吸光值要大于150 g·L-1濃度下的吸光值，見表4，所以實驗中采用0.5 mL提取液+0.75 mL 100 g·L-1碳酸鈉+0.75 mL偶氮試劑。

2.1.6 反應溫度、時間和穩定性

反應時間太短，溶液會呈橘黃色，而偶氮反應在室溫條件下10 min以上才能充分完成，因此加完偶氮試劑后應放置10 min再進行檢測。有色化合物形成后20 min內溶液紅色不改變，吸收特征無變化。樣品溶液穩定，適合直接測定。顯色反應隨時間的變化見圖5，可以看出，10 min后顯色反應穩定，20 min后吸光值開始下降。

2.2 產品方法性能指標的測定

產品方法性能指標的測定結果見表5。結果表明該方法的靈敏度和特異性均為100%、假陰性率和假陽性率均為0%。

2.3 交叉反應結果

色胺、腐胺、β-苯乙胺、尸胺、精胺、章魚胺、亞精胺添加濃度為2 500 mg·kg-1時，用組胺標準比色卡進行判定，檢測結果均為陰性，可以表明比色卡法中，上述試劑與組胺均無交叉反應。當酪胺添加濃度為2 000 mg·kg-1時，肉眼可觀察顯色開始為紅色，與組胺標準比色卡的檢出限200 mg·kg-1相近，為盡量避免出現假陰性結果，讀數時遵循就高不就低的原則，結果判為陽性，同時可以表明酪胺與組胺存在一定的交叉反應，酪胺含量達到2 000 mg·kg-1時，交叉反應率為10%左右。

2.4 與參比方法一致性分析

以現行國家標準GB 5009.208—2016第一法液相色譜法作為參比方法，對方法一致性進行研究。與參比方法一致性分析結果見表6，結果表明在檢出限濃度水平（200 mg·kg-1），本方法與參比方法相一致，符合方法一致性要求。

2.5 驗證結果與匯總

6家驗證單位組胺快檢方法驗證結果見表7，產品方法性能指標的測定結果見表8。驗證結果表明該方法的靈敏度和特異性均為100%、假陰性率和假陽性率均為0%。

3 結論

組胺是所有生物胺中對人體健康危害最大的物質，并且組胺的穩定性非常好，即使經過高溫蒸煮后，也不會揮發和發生變化。當人們誤食含有組胺的水產品，并且攝入組胺超過1 000 mg·kg-1時，可能引發過敏性食物中毒現象。所以，國家對水產品中的組胺含量提出了嚴格要求，《食品安全國家標準 鮮、凍動物性水產品》（GB 2733—2015）和《食品安全國家標準 動物性水產制品》（GB10136—2015）中規定，高組胺青皮紅肉魚類及制品中組胺含量應≤400 mg·kg-1，其他海水魚類及制品中組胺含量應≤200 mg·kg-1。因此，將水產品中組胺的快速檢測偶氮試劑法-比色卡法檢出限設定為200 mg·kg-1。當一般魚類和羅氏蝦類的測定結果≥200 mg·kg-1時，高組胺魚類如秋刀魚、鮐魚、鲹魚、鯖魚、沙丁魚、鰹魚、金槍魚、竹莢魚、馬鮫魚、青占魚等青皮紅肉海水魚的測定結果≥400 mg·kg-1時，使用GB 5009.208—2016第一法液相色譜法對結果進行確證。

本方法選用偶氮試劑法-比色卡法快速檢測水產品中組胺進行方法學研究。以水產品中的鱸魚、秋刀魚、羅氏蝦作為研究基質，對本方法的顯著性差異、靈敏度、特異性、假陽性率、假陰性率、相對準確度、參比方法進行一致性分析、交叉反應率等性能指標進行了測試和計算。結果表明本方法的靈敏度和特異性均為100%、假陰性率和假陽性率均為0%、相對準確度為100%；與參比方法相一致；與其他類似生物胺交叉反應率均小于15%。本方法簡單、快捷、時間短、易操作，方法假陰性率和假陽性率低，與國標法分光光度法相比提高了方法的特異性和便捷性，適合于水產品中組胺的快速檢測。

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基金項目：國家市場監督管理總局食品快檢方法編制委托研究項目（KJ202102）。

作者簡介：汪開銀（1989—），男，安徽蕪湖人，碩士，工程師。研究方向：食品質量安全檢測。

通信作者：熊麗莎（1990—），女，江西宜春人，碩士，高級工程師。研究方向：食品質量安全。E-mail：673156041@qq.com。