一株耐鹽高效脫氮微生物的篩選和鑒定

伏春燕 閻佩佩 張亨 商延 高慶濤 李霞 劉雪蘭

摘 要：隨著養殖污水排放量的增加，降低養殖污水中氮素水平，防止水體富營養化，已經成為當今水環境污染防治的熱點問題。為了篩選出具有耐鹽高效脫氮作用的微生物，通過選擇性培養基結合極限稀釋法以及平板劃線法，從6個不同樣本中篩選到了7株耐鹽脫氮微生物，通過對這些微生物脫氮效率的復篩，得到一株脫氮效果最好的菌株（A1），通過表觀分類鑒定、生理生化鑒定及測序分析相結合獲得可靠的鑒定結果。經鑒定，菌株A1與鹽單胞菌屬（Halomonas）相似度最高，在30 g/L鹽濃度條件下氨氮去除率達到38.33%。通過對菌株進行相關性質及影響因素的研究，確定了菌種脫氮的最適溫度為25 ℃，最適pH為5。

關鍵詞：氨氮；脫氮微生物；耐鹽；鹽單胞菌屬

近年來，隨著城市化進程的迅速發展，以及工業、農業等活動的加快，水體中的氮素污染現象日益嚴重，危及到人類及牲畜的飲水問題，其中養殖污水又是氮素污染的主要原因之一[1]。畜禽養殖污水中的大量含氮（尤其氨氮）、磷、有機物等污染物，尤其是污水中氮素的去除，若不經過合理處理，其進入水體將引起水體富營養化，必將對水體生態環境造成極大破壞[2-5]。因此，水中氮素的去除已成為當今水環境污染防治的熱點問題。養殖污水成分復雜，存在許多有機鹽、無機鹽、抗生素、尿素、大分子營養物質等，此種復雜條件對生物脫氮提出了更高的要求[6-11]。因此，針對養殖污水中高鹽的特點，對6個樣品進行耐鹽脫氮菌的篩選，旨在篩選出在高鹽條件下仍具有較高脫氮能力的微生物，為脫氮微生物的菌落篩選及生存條件研究等方面提供理論基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣品來源? A樣品來自東營鹽堿農田土壤，已經過預處理，菌樣足夠；B樣品來自山東省農業科學院長期運行的人工濕地基質；C樣品來自濟南污水處理廠的活性污泥；D樣品取自水田（水稻田）土壤；E樣品為旱地（棉花地）土壤；F樣品為河流底泥。

1.1.2? 培養基? （1）富集培養基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 30 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

（2）分離培養基：葡萄糖 5 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，K2HPO4 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，NaCl 30 g/L，CaCl2·H2O 0.03 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，pH 7.2～7.4。加入20%的瓊脂制成固體培養基，用于菌種的分離純化。其中以（NH4）2SO4作為氮的來源[12]。

（3）種子培養基（液）：LB培養基：LB粉25 g/L、NaCl 30 g/L、pH 7.2 斜面培養基加2%瓊脂[13]。

（4）好氧反硝化培養基（DM）：葡萄糖5 g，KNO3 0.5 g，NaNO2 0.5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g，微量鹽溶液2 mL，蒸餾水1 L，pH 7.2，固體培養基加2%的瓊脂[14-15]。

（5）微量鹽溶液：乙二胺四乙酸50 g，ZnSO4 2.2 g，CaCl2 5.5 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，MnCl2·4H2O 5.56 g，FeSO4·7H2O 5 g，CoCl2·6H2O 1.61 g，蒸餾水1 L，pH 7.0～7.2[16]。

（6）脫NH4+-N發酵培養基（液）：葡萄糖 5 g/L，（NH4）2SO4 0.7g/L，NaCl 30 g/L，FeSO4·7SO4

0.05 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，pH 7.2～7.4[17-18]。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 細菌的篩選分離? （1）耐鹽脫氮微生物的篩選：取樣品各2 g，分別接入無菌水中，于30 ℃ 180 rpm條件下振蕩培養3 h，靜置，取細菌懸液5 mL轉入100 mL富集培養基中，在相同條件下培養48 h，得到富集菌液；制備一系列該培養液的稀釋液（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6），取100 ?L涂布在倒置的分離培養基中，于30 ℃下恒溫培養48 h，每天觀察記錄菌體長勢。挑取菌落形態各異的菌株，進行劃線分離；經多次劃線分離后，得到純菌株。

（2）好氧反硝化篩選：將純化出的菌株通過劃線方式接入好氧反硝化培養基，篩選出具有好氧反硝化能力的菌株[19]。

（3）高效耐鹽脫氮微生物篩選：將純化后的各菌株分別接入富集培養基活化1 d，再取5 mL接入100 mL分離培養基中，于30 ℃ 180 rpm條件下搖床培養48 h，分別于24 、48 h取樣通過納氏比色法測定培養基中 NH4+-N的濃度，計算總脫氮率和氨氮降解率。每個菌種設三組。根據總脫氮率和氨氮降解率，挑選脫氮效果好且生長速度快的菌株進行下一步試驗。

1.2.2? 菌株保藏? 選擇轉化率最高的菌株，作為目的菌株，接種于LB斜面培養基上，4 ℃冰箱保藏。

1.2.3? 耐鹽高效脫氮微生物適宜培養條件研究? ? （1）溫度對菌株的影響：取保存的菌種以5%（V/V）的接種量接種至NH4+-N發酵培養基中，分別置于20 、25 、30 、35 ℃ 和40 ℃，150 rpm搖床震蕩培養1 d，檢測樣品氨氮含量和菌液光密度[20]。

（2）pH對菌株的影響：分別配制pH值為4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的脫NH4+-N發酵培養基，取保存的菌種按5%（V/V）的接種量接種于上述培養基中，30 ℃、150 rpm搖床震蕩培養，1 d后檢測樣品氨氮含量和菌液光密度[21]。

（3）鹽度對菌株的影響：取保存的菌種，按5%（V/V）的接種量分別接種至鹽度值為5、10、20和30的脫NH4+-N發酵培養基中，30 ℃、150 rpm搖床震蕩培養，1 d后檢測樣品氨氮含量和菌液光密度[22]。

1.2.4? 耐鹽高效脫氮微生物鑒定? 包括菌株形態觀察、革蘭氏染色、16S rRNA測序和分析、生理生化鑒定等。16S rRNA委托山東力戈科技公司進行，序列同源性分析在NCBI采用blast軟件檢索，參考序列取自Genbank數據庫。生理生化鑒定包括甘油試驗、葡萄糖糖發酵試驗、H2S試驗、硝酸鹽還原試驗、靛基質試驗、MR-VP試驗、明膠液化試驗[16]。

2? 結果與分析

2.1? 耐鹽脫氮微生物的篩選結果及其菌落特征分析

對6個樣品進行富集培養、梯度稀釋（10-1～10-6）后涂布在倒置的分離培養基平板上，并反復分離純化，得到單菌株，進行菌落形態觀察，見圖1。

2.2? 反硝化的篩選結果

接入反硝化培養基的七種菌均無菌落長出，證明七種菌均無好氧反硝化作用。

2.3? 耐鹽高效脫氮微生物篩選結果

通過納氏比色法測定接有各菌種的培養基中不同時間的吸光度值如表2，計算各菌種48 h脫氮率如表3。菌株A1具有較高的脫氮效率，其氨氮降解率達到38.33%，明顯高出其他菌種，可作為目標菌種，進行下一步實驗。

2.4? 適宜培養條件研究結果

2.4.1? 溫度條件? 通過測定，A1在25 ℃條件下脫氮能力最強（圖2），氨氮降解率為33.2%，在30 ℃時菌體細胞密度最大（圖3）。

2.4.2? pH條件? 通過測定，A1在pH為5條件下脫氮能力最強（圖4），氨氮降解率為39.7%；在pH為8時OD600最高，與其他幾個梯度顏色差異較為明顯，考慮到培養基顏色對吸光度值的影響，此處認為pH為6～7時菌體細胞密度最大（圖5）。

2.4.3? 鹽度條件? 隨著鹽度的升高，菌體脫氮能力逐漸降低，在鹽度為5、10、20、30時，氨氮去除率分別為50.44％、47.5％、46.31％、40.32％，顯示A1在鹽度為30的情況下仍具有較好的脫氮能力（圖6）。

據圖7可知，鹽度在10～20的條件下，菌液細胞密度變化不明顯；鹽度為20時，菌液細胞密度達到最高值，故可得出A1菌體生長的最適鹽度為10～20。

2.5? 分子生物學鑒定結果

A1菌株的16S rRNA擴增片段測序結果為591 bp，將測序結果與Genbank上已登錄的基因序列作比對，發現與鹽單胞菌屬（Halomonas）同源性最高，為97.71%。利用MEGA6軟件，將分離菌株與部分參考菌株基于16S rRNA序列構建系統發育樹，確定其進化地位。

2.6? ?生理生化鑒定結果

分離菌株A1的生理生化鑒定結果見表4。根據菌株A1的染色結果見（圖8）及生理生化測定（表4）結果，A1菌為革蘭氏陽性的桿菌，運動型，硝酸鹽還原試驗陽性，葡萄糖發酵陰性，明膠液化試驗陰性。

3? 結論

本研究從東營鹽堿土地中篩選出一株具有耐鹽高效脫氮的革蘭氏陽性桿菌菌株A1，屬鹽單胞菌屬，脫氮最適溫度為25 ℃、最適pH為5、最適鹽度為30，對于去除畜禽污水中氮素、水環境污染防治具有重要的應用價值。

參考文獻：

[1]? 鄧斌，鄭佳佳，傅羅琴，等.一株高效硝化菌的鑒定及其特性[J].環境工程學報，2013，7（9）：3635-3641.

[2] 劉平，陳芳艷，謝永福，等.一株脫氨除臭菌的篩選鑒定及其脫氮性能研究[J].中國畜牧獸醫，2013，40（5）：40-43.

[3]? 楊壘.高效異養硝化細菌的脫氮特性及其處理高氨氮廢水研究[D].西安：西安建筑科技大學，2016：41-68.

[4]? 賈燕，江棟，周偉堅，等.高效脫硫脫氨氮菌株的分離、鑒定及特性研究[J].中國給水排水，2009，25（23）：114-116.

[5]? 楊新萍.污水處理中脫氮功能微生物特性及固定化應用研究[D].南京：南京農業大學，2009：31-70.

[6] 劉健楠.廢水處理系統中脫氮菌株的分離、篩選與鑒別研究[D].北京：北京工商大學，2010：1-68.

[7] 陳亮，劉鋒，肖潤林，等.人工濕地氮去除關鍵功能微生物生態學研究進展[J].生態學報，2017，37（18）：6265-6274.

[8]? 陳銀燕.異養同步硝化好氧反硝化細菌的脫氮性能研究[D].杭州：浙江農林大學，2019：1-50.

[9]? 陳相林.人工濕地對水產養殖廢水中氮磷的去除效能分析[J].江西水產科技，2020（2）：37-38.

[10] 王宇娜，國曉春，盧少勇，等.人工濕地對低污染水中氮去除的研究進展：效果、機制和影響因素[J].農業資源與環境學報，2021，38（5）：722-734.

[11] 蘇俊峰，王繼華，馬放，等.好氧反硝化細菌的篩選鑒定及處理硝酸鹽廢水的研究[J].環境科學，2007（10）：2332-2335.

[12] 陳蘇蘭.豬場污水中脫氮微生物的分離與鑒定的研究[D].武漢：華中農業大學，2007：3-25.

[13] 宋慧赟，王瑩，陳虎，等.鹽度對新型生物脫氮技術影響的研究進展[J].化工進展，2021，40（4）：2298-2307.

[14] 芮傳芳.脫氮微生物的篩選及其脫氮性能研究[D].合肥：安徽大學，2011：4-14.

[15] 邱曉帆. 脫氮微生物篩選及脫氮條件優化研究[D].無錫：江南大學，2012：1-37.

[16] 李慧，李宇飛，孟子育，等.螭霖魚腸道微生物多樣性分析[J].水產養殖，2020，41（8）：1-21.

[17] 吳占東.極地微生物中脫氮菌篩選與脫氮性能的研究[D].青島：青島大學，2017：1-18.

[18] 趙燕.耐冷氨氮降解菌的分離、鑒定及其在廢水處理中的應用研究[D].蘭州：蘭州交通大學，2013：3-15.

[19] 袁建華，趙天濤，彭緒亞.極端條件下異養硝化-好氧反硝化菌脫氮的研究進展[J].生物工程學報，2019，35（6）：942-955.

[20] AVGU?TIN J A，BERTOK D ?，AVGU?TIN G.Isolation and characterization of a novel violacein-like pigment producing psychrotrophic bacterial species Janthinobacterium svalbardensis sp. nov[J].Antonie van leeuwenhoek，2013，103（4）：763-769.

[21] LU H，DENG T，CAI Z，et al.Janthinobacterium violaceinigrum sp. nov.， Janthinobacterium aquaticum sp. nov. and Janthinobacterium rivuli sp. nov.， isolated from a subtropical stream in China[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology，2020，70（4）：2719-2725.

[22] BARICZ A，TEBAN A，CHIRIAC C M，et al.Investigating the potential use of an antarctic variant of janthinobacterium lividum for tackling antimicrobial resistance in a one health approach[J].Scientific reports， 2018，8（1）：1-12.