根瘤內(nèi)生菌群對南洋楹苗木生長的影響

林千禧，鄭會全，路國輝，黃 榮，韋如萍，王潤輝，晏 姝*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631；2. 廣東省林業(yè)科學(xué)研究院/廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣東 廣州 510520)

根瘤菌（Rhizobia）是革蘭氏陰性無芽孢細菌，能在豆科植物根系分泌的黃酮類化合物激活下誘發(fā)根瘤共生體系的形成[1-3]。根瘤是生物固氮的主要場所，能促進植物和微生物間代謝物和固氮產(chǎn)物的交換，在全球氮循環(huán)、生態(tài)改良和農(nóng)林生產(chǎn)等方面發(fā)揮著重要作用[4]。前人研究發(fā)現(xiàn)，根瘤內(nèi)不僅有根瘤菌，其中還存在著大量非根瘤菌（Nonrhizobia endophytes）[5]，它們與根瘤菌以及與植物體、土壤環(huán)境之間相互作用形成了特殊的微生態(tài)系統(tǒng)。多數(shù)根瘤菌能促進植物生長、增加土壤有機碳、速效氮和全氮含量，發(fā)揮典型的肥力島效應(yīng)[6-7]，而根瘤內(nèi)其他內(nèi)生菌雖不能誘導(dǎo)結(jié)瘤，但對宿主植物有促生、抗病、內(nèi)生聯(lián)合固氮等作用，因而也越來越受到關(guān)注[8-12]。Rajendran 等[13]研究表明，單獨接種木豆內(nèi)生芽孢桿菌不能使木豆結(jié)瘤或促生而只能提高葉綠素含量；但與根瘤菌共接種時，對植株鮮質(zhì)量、葉綠素含量等均有促進作用。Ibáez等[14]發(fā)現(xiàn)，阿根廷的花生(Arachis hypogaeaL.)根瘤中的Pseudomonasspp.、Enterobacterspp.等內(nèi)生細菌，在與Bradyrhizobium共生菌株混合接種花生時可以增加作物產(chǎn)量。李繼紅等[15]發(fā)現(xiàn)大豆根瘤中幾乎所有菌株都產(chǎn)生IAA，部分可溶解磷礦物，少數(shù)具有固氮能力。

南洋楹（Falcataria falcata） 是豆科Leguminosae 南洋楹屬Falcataria常綠喬木，是國際林業(yè)研究協(xié)會(IUFRO)大力推廣的速生固氮樹種之一。我國自1940 年開始引種南洋楹，該樹種在廣東、廣西等南方省（區(qū)）表現(xiàn)出較強的適應(yīng)性和速生性，6 a生平均樹高14.5 m、平均胸徑17.5 cm[16]，無愧于“植物賽跑家”的稱號。南洋楹的速生特性決定了其生長發(fā)育需要充足養(yǎng)分[17-20]，苗期常采用高劑量配方施肥配合精細管理等方式[18-20]。而采用接種結(jié)瘤促生的方式鮮有報道[21]。基于根瘤菌與其他內(nèi)生菌群協(xié)同增效的“菌-菌互作”原理，本研究以不同來源南洋楹根瘤提取液為接種菌液，開展南洋楹苗木接種對比試驗，探究微生物共生對其苗期生長結(jié)瘤、生物量積累、光合及固氮的影響，并運用高通量測序技術(shù)對回接根瘤16S rRNA 基因全長測序，并以Silva.138 為參考數(shù)據(jù)庫進行物種注釋，揭示相對豐度較高的根瘤內(nèi)生菌與南洋楹苗木重要生長指標的關(guān)系，以期為南洋楹微生物菌肥研發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時也可為今后擴展根瘤菌研究視野以及科學(xué)利用根瘤中某些非根瘤菌提供依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1 接種菌液來源

采樣地包括位于廣東省中部的廣州市（113.373 719°E，23.194 212° N）、東部的惠州市（114.241 918°E，23.201 885° N）和西部的茂名市（111.248 662°E ，21.628 686° N）3 個南洋楹苗木培育基地，選擇上述3 個基地中同一種子來源、同一育苗方式培育的0.5 年生優(yōu)質(zhì)南洋楹苗木各5 株，分別采集其根系上天然生長的飽滿、肉色至粉色的球形根瘤10 顆。用清水沖洗去根瘤表面雜質(zhì)，在超凈工作臺中，依次用75% 乙醇溶液30 s、0.1% 升汞溶液8 min 消毒、無菌水清洗5 次后放入潔凈離心管中，加入300 μL 無菌水，用無菌研磨棒將根瘤壓碎。靜置5 min 后，吸取上層液體至200 mL YMA 液體培養(yǎng)基中，28 °C 恒溫搖床120 rpm 條件下振蕩培養(yǎng)2 ～4 d，分光光度計檢測菌液OD600值為1.2 時[22]，獲得接種菌液，編號分別為YZ、YD、YX。

1.2 供試苗木培養(yǎng)

為了盡量控制其他內(nèi)生細菌的干擾和排除不同基因型的生長差異，供接種試驗的南洋楹苗木來源于廣東省林業(yè)科學(xué)研究院自主選育的優(yōu)良無性系178 號組培苗，瓶苗規(guī)格為苗高5 cm 左右的生根芽苗。育苗基質(zhì)采用實驗室用高純石英砂和蛭石按體積比1∶1 混合，經(jīng)3 次121 °C 滅菌25 min，分裝于9.5 cm（內(nèi)口徑） × 8 cm（高）塑料育苗袋中。將移栽組培苗放入經(jīng)紫外燈消毒的人工氣候箱中培養(yǎng)，光照強度7 000 lux， 溫度28 °C 、濕度75%、光照時間12 h，每天以純水噴施保持基質(zhì)濕潤。移栽組培苗14 d 左右生長穩(wěn)定。

1.3 接種與施肥試驗設(shè)計

選取移栽健康成活的苗木以澆灌方式接種，將菌液均勻澆灌于基質(zhì)表面使其滲透，每株10 mL。采用完全隨機區(qū)組試驗設(shè)計，設(shè)4 個處理，即分別接種YZ、YD、YX 和對照（澆灌等量無菌YMA 液體培養(yǎng)基），每個處理9 株重復(fù)。試驗期間所有苗木每天噴施純水1 次，每15 d 施加Jensen 無氮營養(yǎng)液1 次，每盆每次施加10 mL，共計施加營養(yǎng)液4 次。

1.4 指標測定

苗木移栽培養(yǎng)3 個月后，在不同處理中各選取3 株生長正常的平均苗，即每個處理共計9 株作為待測植株。將苗木從基質(zhì)中小心挖出、洗凈后用吸水紙控干、待測。用SPAD-502 葉綠素儀測定每株中層的成熟葉片的相對葉綠素含量（SPAD,Specialty Products Agricultural Division），每株測定5 片，取其平均值；以直尺測量每株苗高、根系自然舒展后密度達80%以上處的長度（精確到0.1 cm），電子數(shù)顯游標卡尺測量地徑（精確到0.01 mm），摘取每株根瘤并統(tǒng)計單株結(jié)瘤數(shù)，以1/1 000 電子天平稱量每株的地上部分、地下部分及總根瘤鮮質(zhì)量。再將苗木地上部分與地下部置于105 °C 烘箱中殺青30 min，在85 °C 下烘至質(zhì)量恒定，并在干燥器中冷卻后，用電子天平稱取地上部、地下部干質(zhì)量。

采用硫酸-雙氧水消解-凱氏定氮法[23]測定植株的全氮含量；

式中：M為總氮量，a為總干質(zhì)量，b為含氮量，N為固氮量，Mx為接種根瘤菌的南洋楹的總氮量，M0為未接種根瘤菌的南洋楹的總氮量，E為固氮效益。

1.5 根瘤內(nèi)細菌DNA 序列測定及物種注釋

分別收集3 個接種處理待測植株的全部回接根瘤，送北京百邁克生物科技有限公司提取根瘤內(nèi)細菌DNA，進行16S rRNA 基因全長測序，將測得的菌株序列使用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的BLAST 程序在線比對，并從 GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載與待分析序列相近的已知種模式菌株的16S rDNA 序列，用DNAMAN 進行多重比對，確定各菌株的種屬分類地位。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 整理數(shù)據(jù)。使用SPSS 25.0、SAS 8.0、TBtools 等執(zhí)行統(tǒng)計分析及圖表繪制，均值顯著性檢驗采用單因素方差分析和LSD 多重比較（p＜0.05），相關(guān)性分析采用Pearson法（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同試驗處理對南洋楹苗木生長結(jié)瘤的影響

苗木移栽3 個月后，3 個接種處理及對照苗木均能正常生長（圖1A），苗木生長與結(jié)瘤測定結(jié)果表明（圖1B），接種處理的苗高、地徑、根長、根瘤數(shù)、根瘤鮮質(zhì)量等均比對照有極顯著的增長（p＜0.01）。其中YZ 處理的苗木長勢最優(yōu)，苗高、地徑和根長等3 項生長指標值分別達到14.38 cm、2.26 mm、11.25 cm，與對照相比增幅超過或接近90%，YD 處理與YX 處理的3 項指標高于對照48.87%～70.59%。進行接種處理的苗木均能成功接根瘤，而對照根系未見根瘤（圖1A）；不同接種處理的結(jié)瘤數(shù)差異較明顯，數(shù)量以YZ 最多，YD 和YX 的結(jié)瘤數(shù)量相當(dāng)，3 個處理的根瘤鮮質(zhì)量相差并不大。

圖1 不同處理下南洋楹苗木生長與結(jié)瘤對比圖Fig. 1 Comparison of growth and nodulation of Falcataria falcata seedlings under different treatments

2.2 不同試驗處理對南洋楹苗木生物量積累的影響

對不同試驗處理苗木的地上部分生物量和地下部分生物量分析，結(jié)果（圖2）表明，接種處理的地上部鮮質(zhì)量、地上部干質(zhì)量、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量及總鮮質(zhì)量、總干質(zhì)量等均顯著地高于對照（p＜0.05）。其中，地上部分鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別比對照增加4.4～7.7 倍和5.5～9.3 倍，地下部分鮮質(zhì)量和干質(zhì)量分別比對照增加了4.6 ～10.5 倍和12.0～21.0 倍；3 個接種處理間的根干質(zhì)量差異不顯著（p＞0.05），YZ 處理的生物量積累大于YD 和YX 處理。

圖2 不同處理下南洋楹苗木生物量對比柱狀圖Fig. 2 Contrast histograms of the biomass of Paraserianthes falcataria (L.) Nielsen seedlings under different treatments

2.3 不同試驗處理對南洋楹苗木光合及固氮的影響

對不同試驗處理南洋楹苗木的光合及固氮效應(yīng)相關(guān)指標測定分析，結(jié)果（圖3）表明，不同接種處理的南洋楹苗木的相對葉綠素含量（SPAD）、總氮量、固氮效益均顯著地高于對照（p＜0.05），含氮量和固氮量與對照差異顯著（p＜0.05）。YZ、YD、YX 處理與CK 相比，SPAD 分別增長了86.18%、78.53%和74.04%，但3 個接種處理間的SPAD 值差異不顯著；含氮量分別增長了53.50%、28.25%和23.09%；總氮量分別增加了15.9、10.1、7.6 倍；固氮效益分別增長了26.51%、11.48% 和12.85%，3 個接種處理間無顯著差異。

圖3 不同處理對南洋楹苗木SPAD 和固氮效應(yīng)對比柱狀圖Fig. 3 Contrast histograms of effects of different treatments on biomass of Falcataria falcata seedlings

2.4 回接根瘤內(nèi)主要細菌及其與南洋楹苗木生長的關(guān)聯(lián)性分析

2.4.1 根瘤內(nèi)主要細菌及多樣性 圖4、表1 中展示了接種YZ、YD、YX 處理后分別從對應(yīng)苗木根系上收獲的根瘤內(nèi)生菌種水平的相對豐度數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，接種不同來源的根瘤提取液能夠形成不同的根瘤內(nèi)生菌群落。其中，YZ 處理的根瘤內(nèi)10 種細菌的相對豐度最為均衡，細菌Cenchrus americanus相對豐度最高，為12.12%，其次為敏捷生絲微菌（Hyphomicrobium facile） 和埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii） ，相對豐度分別為9.94% 和7.66%。YD 處理的根瘤內(nèi)，細菌Cenchrus americanus、 埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii）、 敏捷生絲微菌（Hyphomicrobium facile）處于主體地位，相對豐度分別為16.74%、8.28% 和21.08%，僅這3 種細菌的相對豐度幾乎達到全部細菌的50%；YX 處理的根瘤內(nèi)豐度最大的3 種內(nèi)生菌與YD 處理相同，其中埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii）相對豐度達22.41%；此外，YX 中還含有3.5% 的根瘤菌（Rhizobium azooxidifex），含根瘤菌最為豐富。YZ 與YD 處理的埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii）相對豐度比較接近，分別為7.66%和8.28%。YZ、YD、YX 處理的根瘤的OTU 數(shù)分別為234、206、191 依次遞減，YZ 處理的根瘤內(nèi)香農(nóng)指數(shù)分別為5.54、4.83、4.61，也呈現(xiàn)依次遞減的趨勢。

表1 不同處理根瘤內(nèi)種水平上相對豐度前十的細菌占比及多樣性指數(shù)Table 1 The proportion and diversity index of the top 10 bacteria in relative abundance at species level of nodules amomg different treatments

圖4 不同處理根瘤內(nèi)種水平多樣性柱狀圖Fig. 4 Histogram of species level diversity within the root nodules of different treatments

2.4.2 苗木重要指標的提取 對南洋楹苗木生長與結(jié)瘤、生物量積累、光合及固氮等相關(guān)指標進行主成分分析，結(jié)果（表2）表明，兩個主成分即PC1、PC2 分別解釋總變異的77.14%、15.29%，二者累積貢獻率達92.43%。其中第一主成分（PC1）主要由苗高、根長、根瘤數(shù)、總氮量和固氮量決定，均為正相關(guān)；第2 主成分（PC2）主要由SPAD 決定，載荷量為0.728 0，且表現(xiàn)正相關(guān)。因此，以苗高、根長、根瘤數(shù)、SPAD、總氮量和固氮量等指標來表征南洋楹苗木的綜合情況。

表2 南洋楹生長指標主成分特征值、貢獻率、累積貢獻率及主成分分析因子載荷陣Table 2 The eigenvalue,proportion，cumulative and eigenvectors of the principal component factors(growth index) of Falcataria falcata growth index

2.4.3 根瘤內(nèi)生菌組成與苗木生長的相關(guān)性分析

選取各樣品中相對豐度前五的7 種根瘤內(nèi)生菌（表1），和提取到的7 個主成分（表2）進行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖5）表明：內(nèi)生菌Cenchrus americanus、Pelomonas puraquae都與南洋楹苗高和根瘤數(shù)呈極顯著負相關(guān)關(guān)系（p＜0.01）；細菌denitrifying Fe-II oxidizing bacterium與苗高、根瘤數(shù)呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與含氮量、總氮量和固氮量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.05）；OTU 數(shù)和香農(nóng)指數(shù)均與苗高和根瘤數(shù)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.01），且香農(nóng)指數(shù)還與含氮量、總氮量和固氮量呈顯著相關(guān)關(guān)系（p＜0.05）。

圖5 南洋楹根瘤內(nèi)生菌與生長指標、OTU 數(shù)及香農(nóng)指數(shù)的相關(guān)分析Fig. 5 Correlation coefficient between nodules of Paraserianthes falcataria (L.) Nielsen and growth index, OTU number and Shannon index

3 討論

豆科植物結(jié)瘤固氮及其生產(chǎn)實踐應(yīng)用研究在花生(Arachis hypogaeaL.)、大豆（Glycine max(Linn.) Merr.)、苜蓿(Medicago sativaL. ) 等蝶形花亞科的農(nóng)作物和牧草中最為成熟[24-26]。而木本豆科植物已有相關(guān)研究結(jié)果也表明，格木（Erythrophleum fordiiOliv.）、銀合歡（Leucaena leucocephala(Lam.) de Wit）、 海南紅豆（Ormosia pinnata(Lour.) Merr.）等回接高效根瘤菌菌株后，植株的苗高、干質(zhì)量及總氮量分別比對照植株提高0.7～3.2、1.3～15.8、1.3～14.8倍[27]；回接黑木相思根瘤菌株 RITF522 的黑木相思（Acacia melanoxylonR.Br. ） 和銀合歡(Leucaena leucocephala(Lam.) de Wit)，生物量比不接種處理分別增加了 110.1%和59.8%，促生效果顯著[28]；SARR 等[29]在播種后立即接種含根瘤菌混合物的可溶藻酸鹽微珠，觀察到其對金合歡屬阿拉伯膠樹（Acacia senegal(Linn.) Willd）和阿拉伯金合歡（Acacia nilotica(L.) Delile）的生長有明顯促進作用。Dhiman 等[30]發(fā)現(xiàn)與對照植株相比，施加根瘤菌組合PGPR1 + PGPR2 能顯著提高印度黃檀（Dalbergia sissooRoxb. ex DC.）的根系和地上部生物量、結(jié)瘤狀況及固氮酶活性生長指標。而本研究以來源不同根瘤提取液為接種菌液，進行接種處理的南洋楹苗木均能成功結(jié)根瘤。不同接種處理的結(jié)瘤數(shù)差異較明顯，數(shù)量以YZ 最多，YD 和YX 的結(jié)瘤數(shù)量相當(dāng)，而3 個處理的根瘤鮮質(zhì)量相差并不大，可見接種YD 和YX 的單個根瘤形態(tài)相對較大。與對照相比，苗高增長了53.74%～95.65%，地徑增加了48.74%～89.92%，根長增長了52.91%～98.41%，干質(zhì)量增加了6.4～11.0 倍，SPAD 增長了74.04%～86.18%，含氮量分別增長了23.09%～53.50%；總氮量上比CK 增加了7.6 ～15.9 倍，固氮效益增加了11.48%～26.51%。可見，不同試驗處理對南洋楹苗木生物量積累效應(yīng)的影響趨勢與苗木生長結(jié)瘤效應(yīng)基本一致，接種處理可顯著促進苗木生物量的積累，特別是極大促進了根系的生長發(fā)育、改變根系的空間結(jié)構(gòu)，使根系網(wǎng)絡(luò)更加錯綜復(fù)雜、緊密交織。然而，不同來源的接種菌液對南洋楹苗木的促生效果存在一定差異，其中接種菌液YZ 對生長結(jié)瘤和固氮效果最為顯著，該研究結(jié)論可為南洋楹微生物菌肥的研發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

豆科植物根瘤內(nèi)存在除共生根瘤菌外的其它細菌的現(xiàn)象，是一個不爭的事實。王浩等[31]對不同品種大豆根際細菌的種群結(jié)構(gòu)進行了分析，發(fā)現(xiàn)細菌的種群極具多樣性，以變形桿菌(Proteobacteria)類群為主；中國東北地區(qū)栽培大豆根瘤中既有慢生根瘤菌，也有其他6 個不同屬的內(nèi)生菌 (Pantoea、Acinetobacter、Bacillus、Agrobacterium、Burkholderia、Serratia)存在；段如雁[32]探索了花櫚木（Ormosia henryiPrain）根瘤細菌主要由Rhizobium、Bacillus、Bradyrhizobium、Devosia、Pseudomonas等61 屬細菌組成，且不同緯度采集的花櫚木根瘤內(nèi)細菌組成差異較大。本研究發(fā)現(xiàn)，來源不同的南洋楹根瘤提取液能夠與南洋楹根系形成具有不同內(nèi)生菌群組成的根瘤，并在種水平上都以埃氏慢生根瘤菌、慢生根瘤菌等不同根瘤菌占比最大，細菌Cenchrus americanus、敏捷生絲微菌、反硝化Fe-Ⅱ氧化細菌等也占有較大豐度；但OTU 數(shù)和香農(nóng)指數(shù)存在一定差異，以接種菌液YZ 回接根瘤中的細菌物種數(shù)最多和α 多樣性最高。對根瘤內(nèi)生細菌及其與植物生長關(guān)系的研究中，常體現(xiàn)為菌-菌互作、協(xié)同增效的互惠模式，也存在某些功能基因在根瘤內(nèi)生細菌之間發(fā)生橫向轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[33-34]，在根瘤微生態(tài)學(xué)研究上具有非常重要的意義。在本研究發(fā)現(xiàn)，與南洋楹生長結(jié)瘤及固氮效應(yīng)密切正相關(guān)的是OTU 數(shù)及香農(nóng)指數(shù)，而并非某種特定細菌，由此可反映出根瘤內(nèi)生菌種類越豐富、相對豐度越均衡，對南洋楹幼苗協(xié)調(diào)增效作用越顯著。值得提出的是，南洋楹根瘤內(nèi)豐度占比較大、與重要生長指標相關(guān)性顯著的Cenchrus americanus、Pelomonas puraquae和反硝化Fe-II 氧化細菌等3 種細菌均屬于變形菌門β 變形菌綱伯克氏菌目的叢毛單胞菌科（Comamonadaceae），但細菌Cenchrus americanus與南洋楹苗高和根瘤數(shù)目呈現(xiàn)極顯著負相關(guān)（p＜0.01），而反硝化Fe-Ⅱ氧化細菌與生長結(jié)瘤、固氮和相對葉綠素含量均有不同程度的正相關(guān)關(guān)系，推測是前者能降解根瘤素從而阻礙根瘤的形成，進而對南洋楹幼苗生長起到負面作用。對于后者，有研究表明，與之同屬細菌Aquabacterium pictumsp. nov.是第一個含有葉綠素a 的好氧革蘭氏陰性細菌[35]，而SPAD又與凈光合速率高度正相關(guān)[36]，故推測南洋楹根瘤中的該細菌與葉片中SPAD 具有關(guān)聯(lián)性，可通過調(diào)控光合作用效率[37]、提高植物的光合作用，加強共生固氮作用的能源的供應(yīng)從而促進苗木的生長，其具體作用機制和效果有待進一步純化培養(yǎng)后觀測研究。

4 結(jié)論

南洋楹根瘤提取液能對南洋楹苗期的生長與結(jié)瘤、生物量積累、光合及固氮起到積極的促進作用，不同來源的接種菌液對苗木的促生效應(yīng)及回接根瘤內(nèi)生菌群組成存在一定差異，其中來源于廣州市南洋楹苗木培育基地的接種菌液（YZ）對苗木促生、結(jié)瘤和固氮效應(yīng)最為顯著；3 種接種菌液的回接根瘤中，種水平上都以埃氏慢生根瘤菌、慢生根瘤菌等不同根瘤菌占比最大，但接種菌液YZ 回接根瘤中的細菌物種數(shù)最多和α 多樣性最高，該2 項指標與南洋楹苗高、根瘤數(shù)、含氮量、總氮量和固氮量等呈極顯著或顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.01或p＜0.05），反映出根瘤內(nèi)生菌種類越豐富、相對豐度越均衡，對南洋楹幼苗促生和固氮作用越顯著。