牡丹花青素苷合成關鍵基因PsDFR啟動子活性分析

周 琳，袁 夢，齊 宇,2，張夢杰，王 雁*

(1. 中國林業科學研究院林業研究所，國家林業和草原局林木培育重點實驗室，北京 100091；2. 山東省農業科學研究院，山東 濟南 250100)

花色是觀賞植物重要的園藝性狀，也是吸引傳粉者的主要因素[1-3]。花青素苷對植物呈色起重要作用[4]。在其生物合成途徑中，二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase，DFR）是下游階段的關鍵酶，可催化二氫黃酮醇還原為無色花青素苷元，進而轉變成橙色到磚紅色的天竺葵素糖苷、紅色的矢車菊素糖苷和藍色到紫色的飛燕草素糖苷，與花色的產生直接相關[4]。目前，DFR基因的克隆及其功能分析已在亞洲百合（LiliumAsiatic hybrids）[5]、 玫 瑰 （Rosa rugosaThunb.）[6]、牽?；ǎ↖pomoea nil(L.) Roth.）[7]、一品紅（Euphorbia pulcherrimaWilld. ex Klotzsch）[8]、馬櫻杜鵑（Rhododendron delavayiFranch.）[9]和橙花龍膽（Gentiana luteaL. var.aurantiaca(M. Laínz) M. Laínz）[10]等多種觀賞植物中得到研究。

對不同植物的研究發現，DFR在轉錄水平上的調控機制十分復雜，受光照、溫度、激素等一系列外部環境和內部因子的影響。孟祥春等[11]研究發現經過短暫光照處理的非洲菊（GerberahybridaHort.）花青素苷含量及DFR基因表達量均顯著增加，且基因表達水平與光照時間呈正相關。在蕪菁（Brassica rapaL.）中，與花青素苷積累相關的BrDFR對冷脅迫表現出明顯響應[12]。紫花苜蓿（Medicago sativaL.）[13]、歐洲油菜（Brassica napusL.）[14]和金魚草（Antirrhinum majusL.）[15]中的DFR基因可分別響應干旱、鹽和植物激素等非生物脅迫，轉錄水平發生明顯變化。

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）是我國的傳統名花，具有極高的觀賞價值和經濟價值。研究表明，PsDFR在牡丹花色形成中起重要作用[16-18]，不僅作為轉錄因子PsbHLH1 的靶基因參與調控花青素苷的生物合成，還可能與轉運蛋白PsGSTF3互作，與花青素苷的轉運和積累相關[19-20]。啟動子是位于結構基因上游的一段DNA 序列，包含控制基因表達的多種調控元件，能夠特異性結合RNA 聚合酶，在基因表達調控中起核心作用[21]。開展啟動子研究對于理解基因的時空表達模式[22]、環境響應機制[23]等具有重要意義。

本研究利用染色體步移法從牡丹花瓣中克隆了PsDFR的啟動子序列，對其順式作用元件進行了分析，探究了不同長度缺失啟動子的活性及其對ABA、MeJA、光照等不同脅迫處理的響應，并初步確定了相關調控區域，為進一步研究PsDFR啟動子的功能及其在牡丹花色形成中的轉錄調控機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以‘黑花魁’牡丹（P.Suffruticosa‘Hei Hua Kui’）盛花期花瓣為試材。于4 月中下旬，取自中國林業科學研究院玉泉山牡丹資源圃，用錫箔紙包好，經液氮速凍后，保存于-80 ℃超低溫冰箱。大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101 購自北京天根生化科技有限公司。煙草（Nicotiana benthamiana）野生型為本實驗室保存，在 23 ℃、16 h/8 h 光暗周期下生長。

1.2 PsDFR 啟動子的克隆和順式作用元件分析

參照北京天根生化科技有限公司Plant Genomic DNA Kit 說明書提取‘黑花魁’花瓣基因組DNA。根據課題組已克隆的PsDFR基因cDNA 序列（Accession No：HQ283448）及前期獲得的牡丹花瓣轉錄組數據庫（ Accession No：PRJNA594258）， 利用生物學軟件Primer Premier 5.0 設計特異引物PsDFR-F/PsDFRR（表1），用于PsDFR基因的gDNA 全長序列擴增。根據測序得到的DNA 序列，在啟動子下游不同位置設計3 條特異性嵌套反向引物SP1、SP2、SP3（表1），以花瓣基因組DNA 為模板，按照TaKaRa 公司的Genome Walking Kit 說明書，連續開展3 輪PCR 擴增。PCR 產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收清晰條帶，連接到pMD-19T 載體上并轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞，挑取轉化平板上的白色菌落進行培養，通過菌液PCR 和質粒酶切鑒定陽性克隆后，委托生工生物公司（上海）測序。

表1 PsDFR 啟動子克隆和活性分析相關引物 Table 1 The primers used in cloning and functional analysis of PsDFR promoters

利用在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）和PLACE（https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?acti on=newplace）分析啟動子序列所包含的調控元件，并用TBtools 軟件繪制各順式作用元件分布圖；通過TSSP 在線網站（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=tssp&group=programs&subgro up=promoter）預測轉錄起始位點。

1.3 不同缺失表達載體的構建

根據PsDFR啟動子的全長序列，設計了5′端分別含有相應側翼序列和酶切位點的擴增引物1301-PsDFRp0-F 和1301-PsDFRp0-R（表1），以包含全長啟動子序列的質粒為模板，通過同源重組方法將PsDFR啟動子構建至pCAMBIA1301-GUS 表達載體上。根據PsDFR啟動子順式作用元件的分布情況，設計了4 條啟動子系列缺失引物，分別命名為PsDFR(1287)-F、PsDFR(980)-F、PsDFR(507)-F 和PsDFR(140)-F（表1）。以上述構建好的PsDFR全長啟動子重組質粒為模板，以1301-PsDFRp0-R 為共用反向引物，通過同源重組方法，構建了不同長度啟動子片段的pCAMBIA1301-GUS 融合表達載體。最后，對含有 5 個不同長度啟動子片段，即1 687 bp （-1 623至 + 64）、1 287 bp （-1 223 至 + 64）、980 bp（-916 至 + 64）、507 bp（-443 至 + 64 ）和140 bp（-76 至 + 64）的重組質粒進行菌液PCR 和測序驗證后，用于啟動子瞬時表達分析。

1.4 重組質粒農桿菌菌液轉化煙草的瞬時表達分析

將構建好的5 個不同長度啟動子融合表達載體的質粒分別轉化到農桿菌GV3101 中。菌液PCR 驗證后，取2 mL 接種于50 mL LB 液體培養基（含50 mg·L-1Rif 、50 mg·L-1Kan 和25 mg·L-1Gen）中過夜培養至OD600=1.0 左右。離心收集菌體，用懸浮液（含10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES 和100 μmol·L-1AS）重懸至OD600約等于0.6，室溫避光靜置3 h 以上后，取2 mL 分別注射到4～5 葉期的煙草葉片中。72 h后取侵染后的葉片放入GUS 染色液進行組織化學染色。70% 乙醇浸泡脫色后拍照記錄。以注射pCAMBIA1301-35S-GUS 空載體的葉片為陽性對照，注射無菌水的葉片為陰性對照。

1.5 不同處理下PsDFR 啟動子的GUS 活性分析

為分析PsDFR啟動子對不同激素的響應，取不同菌液注射2 d 后的煙草植株，對其葉片正反面分別噴灑外源茉莉酸甲酯（MeJA，100 μmol·L-1）和脫落酸（ABA，100 μmol·L-1）直到葉面呈滴水狀態，其中MeJA 噴灑后進行套袋密閉處理。以噴灑清水的煙草葉片為對照，每組設置5 個重復，處理24 h 后取樣（每12 h 追加噴灑一次）。同時，為了解啟動子對光照誘導的響應，對侵染2 d 后的煙草植株分別進行暗培養24 h 后取樣，以及暗培養24 h 后恢復全光照培養12 h 后再取樣兩種處理。每組設置5 個重復。所有樣品經液氮速凍后，置于-80 ℃冰箱保存。參照陰霞等[24]的方法，利用熒光分光光度計檢測GUS 酶活。

運用SPSS19.0 的Duncan’s 新復極差法進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 PsDFR 啟動子克隆及順式作用元件分析

以牡丹基因組DNA 作為模板，利用染色體步移法進行3 次巢式PCR 后，擴增到1 條長為1 687 bp 的目的片段（圖1）。生物信息學預測結果顯示，PsDFR啟動子含有多個CAAT-box，轉錄起始位點位于翻譯起始密碼子ATG 上游63 bp處。轉錄起始位點上游16 bp 處有一個TATAbox 結構（圖2）。

圖1 牡丹PsDFR 啟動子的 PCR 擴增Fig. 1 PCR production of PsDFR promoter from tree peony

圖2 PsDFR 基因啟動子序列Fig. 2 The sequence of the PsDFR promoter

如表2、圖3 所示，PsDFR啟動子除含有核心啟動子元件TATA-box 和CAAT-box 外，還包含參與大多數植物啟動子轉錄起始過程的Inr 元件INRNTPSADB 和大量光調控元件，有G-Box、Box 4、GA-motif、GATA-motif、TCCC-motif 、TCT-motif、GT1-motif 、I-Box 、SORLIP1AT 和TBOXATGAPB 等，以及多個激素和脅迫響應相關元件。其中，激素響應元件包括：ABA 響應元件ABRE 和DPBFCOREDCDC3；細胞分裂素誘導相關元件ARR1AT；乙烯誘導相關元件ERE；GA 響應元件GARE-motif 和TATCCAOSAMY；茉莉酸甲酯響應元件TGACG-motif 等。逆境脅迫響應元件包括： 水分脅迫相關響應元件ACGTATERD1 和CBFHV ； 低溫響應元件CRTDREHVCBF2 以及受傷和病原體應答相關元件W box 等。值得注意的是，其他作用元件中類黃酮生物合成相關的調控元件或轉錄因子識別位點MYBCORE 、MYBPLANT 和MYCCONSEN-SUSAT 多達17 個。 這些元件的存在表明PsDFR在牡丹花青素苷的生物合成中發揮重要作用，并可能在轉錄水平上受到光照、激素（如GA、ABA、乙烯）和非生物脅迫（如干旱、低溫）等多種因素的調節。此外，在PsDFR啟動子序列中還發現了葉肉細胞特異表達作用元件 CACTFTPPCA1 、 花粉特異激活元件POLLEN1LELAT52 和GTGANTG10 等控制基因器官特異表達的作用元件，說明PsDFR在植物體內的表達可能具有一定的器官特異性。

圖3 PsDFR 啟動子順式作用元件分布圖Fig. 3 Distribution map of the cis-elements of PsDFR promoter

2.2 啟動子不同缺失片段的表達載體構建

5 個不同長度的缺失片段（圖4）是根據PsDFR啟動子順式作用元件預測結果，從轉錄起始位點上游1 623 bp 的5′端對啟動子序列進行逐步刪除，最終獲得：1 687 bp（P0，-1 623 至+ 64）、1 287 bp（P1，-1 223 至 + 64）、980 bp（P2，-916 至 + 64）、507 bp（P3，-443 至+ 64 ）和140 bp（P4；-76 至 + 64）。

圖4 PsDFR 啟動子缺失片段Fig. 4 Schematic diagram of the PsDFR promoter deletions

利用同源重組的方法將獲得的PsDFR啟動子全長序列P0構建到pCAMBIA1301-GUS 表達載體上，菌液PCR 和測序結果證明該序列已經替換了原有的35S 啟動子并與GUS 基因融合（圖5），重組質粒被命名為pCAM-PsDFRp0。以該質粒為模板，通過同樣的方法，經菌液PCR 和測序驗證，獲得了另外4 個不同缺失片段的pCAMBIA1301-GUS 融合表達載體pCAM-PsDFRp1、pCAMPsDFRp2、pCAM-PsDFRp3 和pCAM-PsDFRp4（圖5）。

圖5 PsDFR 啟動子及其缺失片段的融合表達載體驗證Fig. 5 Verification of PsDFR promoter and deletion fragment fusion expression vector

2.3 啟動子缺失片段在煙草葉片中的瞬時表達及GUS 染色分析

為研究PsDFR啟動子各區域的表達活性，將含有不同缺失片段的融合表達載體分別轉化農桿菌后，注射至煙草葉片中進行GUS 組織化學染色分析。結果由圖6 所示，注射無菌水的陰性對照的葉片沒有染色，而由啟動子CaMV35S 驅動的陽性對照GUS 染色最明顯。在不同PsDFR啟動子缺失片段的瞬時表達中，隨著啟動子5′端序列的缺失，染色程度由深到淺變化，染色部位也越來越小。特別是全長啟動子P0在相繼缺失了-1 623 至-1 223（P1）以及-1 223 至-916（P2）之間的區域后，缺失材料的GUS 染色明顯變淺，最后僅在葉脈周圍觀察到稀疏分散的藍色斑點，表明5 個缺失片段均具有啟動子活性，但活性隨片段的縮短而減弱，-1 623 至-916 之間的區域對于其活性具有重要作用。

圖6 PsDFR 啟動子缺失片段瞬時轉化煙草染色結果Fig. 6 Detection of transient expression of different PsDFR promoter deletion regions in tobacco leaves

2.4 光照和激素對啟動子不同缺失片段活性的影響

對不同農桿菌侵染48 h 后的煙草分別進行ABA、MeJA、黑暗和光照處理后，檢測葉片GUS活性，結果如圖7 所示，對照中，GUS 活性隨啟動子缺失片段的縮短而不斷降低，這與染色結果（圖6）相一致。黑暗處理后，所有啟動子缺失片段誘導的GUS 酶活性均受到不同程度抑制，恢復光照后，除P4外其余啟動子活性均有顯著升高（p＜0.05）；ABA 處理明顯抑制了P0和P1下游GUS 的表達活性，與對照相比，分別下降了51.85%和56.12%，但隨著5′端序列的逐漸缺失，ABA 對啟動子P2的抑制作用明顯降低，并反而促進了P3的啟動子活性，約達對照的1.28倍；MeJA 明顯抑制了不同啟動子片段誘導的GUS 活性，與對照相比，均下降了40%以上。

圖7 光照和激素誘導下PsDFR 啟動子缺失片段驅動的GUS 活性分析Fig. 7 Analysis of the GUS activity driven by PsDFR promoter deletion regions in response to light and hormone treatments

3 討論

本研究利用染色體步移法從牡丹花瓣中分離到PsDFR基因長1 687 bp 的啟動子序列。該序列位于轉錄起始位點上游的-1 623 bp 處，除了包含調控轉錄起始精確度和效率的核心啟動子元件外，還具有光響應元件、激素和逆境脅迫相關元件以及組織特異性表達相關元件等。

前期研究發現，隨著花朵的著色，PsDFR基因的表達量與花青素苷的含量呈正相關，并且在花瓣中特異高表達，在葉片、萼片、雄蕊和心皮中的表達水平很低[16,25]。然而，除一些花粉特異激活元件外，在PsDFR啟動子中未發現其他花器官相關特異元件。Roh 等[26]通過啟動子缺失發現，花瓣特異性啟動子PISTILLATA（BnPI）中的光響應元件G-box 可能與花瓣特異性表達有關。Imai 等[27]發現在菊花（Dendranthema morifolium(Ramat.)Tzvel.）CmCCD4a的ATG 上游存在一些與花瓣特異性表達相關的未知順式元件。在非洲菊中，不同花器官間的著色差異與DFR啟動子的結構無關，而是由調控其表達的上游轉錄因子啟動子上的空間特異性順式作用元件調控的[28]。因此，為了明確哪些順式元件在PsDFR的花瓣特異性高表達中起重要作用，還需對其啟動子或與其互作的轉錄因子啟動子進行更全面、細致的片段缺失分析。

在啟動子缺失片段的GUS 染色分析中，發現不同區域的PsDFR啟動子表達活性具有明顯差異。全長啟動子片段（P0）活性最高，但隨著5′端序列的逐步缺失，活性不斷降低。特別是刪除-1 623 至-916 之間707 bp 的片段后，啟動子活性迅速下降，推測該片段中可能含有與啟動子活性相關的核心元件。根據順式元件分析結果，發現該片段包含2 個Inr 元件（INRNTPSADB）。Nakamura等[29]證實該元件可在缺乏TATA-box 的情況下對轉錄激活起關鍵作用。在PsDFR啟動子中，Inr 元件是否在TATA-box 存在的情況下也具有激活轉錄起始的作用，還有待進一步研究。

光照是影響植物合成花青素苷的重要環境因子之一，不同光質、光照強度和光周期信號可通過促進或抑制類黃酮合成相關基因的表達，調控花青素苷的合成和積累。Hartmann 等[30]在擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh.）CHS啟動子區域發現了一個由G-Box 核心元件（ACGT）和MYB 識別元件（ACCWACCNN）組成的光響應單元LRU。小麥（Triticum aestivumL.）TaDFRB在花青素苷積累的部位高表達，并受光誘導明顯上調，也與其啟動子中包含這兩個元件有關[31]。本研究中，PsDFR啟動子也含有該元件組合（GBox 和MYBPZM），并同時具有Box4、GAmotif、TCT-motif、GT1-motif、I-Box 等多個光響應元件。光處理后，不同啟動子缺失片段對光照變化均有明顯響應，即在黑暗條件下啟動子活性降低，恢復光照后啟動子活性升高，這與Gollop等[32]對葡萄（Vitis viniferaL.）DFR啟動子的研究結果一致，推測這些元件在牡丹花青素苷生物合成對光照的響應中起重要作用。

除光照外，DFR在表達過程中還受ABA、MeJA 等多種激素影響。如ABA 可上調草莓（Fragaria ananassaDuch.）[33]和葡萄[34]果實中DFR的表達水平，進而促進花青素苷的積累；紅肉蘋果（Malus sieversiif.niedzwetzkyana(Dieck) Langenf.）MdDFR的轉錄受MeJA 正調控，但受ABA 負調控[35]。目前，關于激素如何影響牡丹DFR的表達以及DFR的啟動子活性如何響應激素處理的報道很少。在PsDFR啟動子中，發現了典型的ABA 響應元件ABRE 和DPBFCOREDCDC3 以及MeJA 響應元件TGACGmotif 和T/GBOXATPIN2 。ABA 處理抑制了P0和P1的啟動子活性，但對啟動子缺失片段P2的抑制作用明顯降低，而P3的啟動子活性顯著高于對照，推測這與啟動子-443 至-76 bp 序列區段存在ABA 應答相關元件有關，且-1 623 至-916 bp 之間可能存在抑制ABA 響應的未知元件。在MeJA 方面，盡管MeJA 處理通常被認為可促進花青素苷的積累[36]，但在擬南芥、甘薯（Ipomoea batatasLam.）等植物中發現，受糖信號、品種及組織特異性或處理濃度的影響，MeJA 處理也會對DFR基因的表達及花青素苷合成起抑制作用[37-38]。本研究中，MeJA 處理后各缺失片段的啟動子活性均有明顯下降，推測100 μmol·L-1MeJA 在‘黑花魁’牡丹花青素苷的合成中可能起負調控作用。

4 結論

DFR 是植物花青素苷生物合成下游階段的關鍵酶。本研究通過染色體步移法分離了牡丹PsDFR基因長1 687 bp 的啟動子序列。順式作用元件分析結果表明PsDFR的表達可能受光信號、激素和脅迫等多種信號的共同調節。通過對瞬時轉化煙草葉片的GUS 組織化學染色和酶活性進行分析，明確了PsDFR啟動子活性受光的正調控以及MeJA 的負調控；-1 623 至-916 bp 間的區域對于啟動子活性具有重要作用，-443 至-76 bp 是響應ABA 處理的核心區域。上述結果為進一步揭示PsDFR響應不同環境信號參與牡丹花色形成的調控機制提供參考。