阿奇霉素對胃癌細胞增殖、凋亡及炎癥因子表達水平的影響*

唐 悅,葛曉明,單 廷

江蘇省無錫市第二人民醫院普外科,江蘇無錫 214000

胃癌為消化系統常見惡性腫瘤之一,多發于40歲以上中老年人群。胃癌的治療手段主要根據病情發展階段而定,手術和藥物相結合的治療方式能明顯提高早期胃癌患者生存率。轉移期胃癌一般使用抗菌藥物和細胞毒性化合物(如5-氟尿嘧啶)等化療藥物進行治療,但由于化療藥物的耐藥性和胃癌的易復發性,不能明顯延長胃癌患者生存期。因此,尋找診斷和治療胃癌的有效手段具有重要意義[1-2]。阿奇霉素是一種大環內酯類抗菌藥物,廣泛應用于治療細菌感染和炎癥,具有療效快、作用強及不良反應少等特點[3]。近年的研究發現,阿奇霉素具有抗菌和抗腫瘤作用:不僅可通過阻斷病原菌的轉肽過程治療急性胃炎,還可通過促進非小細胞肺癌細胞凋亡,達到治療肺癌的目的[4]。但關于阿奇霉素調控胃癌細胞生物學功能和影響胃癌惡性進程的相關報道較少。核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路普遍存在于細胞中,在調控細胞生物學過程中起重要作用[5]。有研究顯示,黨參多糖通過抑制NF-κB信號通路誘導胃癌細胞凋亡和抑制增殖[6]。另有研究顯示,阿奇霉素通過抑制NF-κB通路活性對哮喘患者具有一定治療作用[7]。本研究探討阿奇霉素對人胃癌細胞(AGS細胞)上清液中炎癥因子水平及增殖和凋亡的影響,分析NF-κB信號通路在其中的調控作用,旨在為胃癌的治療提供新的參考。

1 材料與方法

1.1細胞 AGS細胞購于上海致備生物科技有限公司。

1.2儀器與試劑 使用的主要儀器包括CO2培養箱(深圳市瑞沃德生物科技有限公司,型號:D180),倒置熒光顯微鏡(上海無陌光學儀器有限公司,型號:WMS-1033),酶標儀(美國Billerica公司,型號:Multiskan Ascent),凝膠成像系統(廣州科適特科學儀器有限公司,型號:GD-1000),低溫高速離心機(山東博科醫用材料有限公司,型號:TGL-16M)等。使用的主要試劑包括阿奇霉素、5-氟尿嘧啶[8](上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%),NF-κB通路抑制劑BAY11-7082[9]、激活劑Prostratin[10](美國MCE公司,純度≥98%),4%多聚甲醛、3%牛血清白蛋白溶液(BSA,上海源葉生物科技有限公司),TritonX-100(北京北京伊塔生物科技有限公司),細胞計數試劑盒-8(CCK-8,上海炎煕生物有限公司),胎牛血清(FBS)、F12K培養基(美國Gibco公司),5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細胞增殖檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),Hoechst33258染色試劑盒(北京蘭博利德有限公司),酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海初態生物有限公司),二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒(英國Abcam公司),鼠抗人增殖細胞核抗原(PCNA)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、NF-κB p65、磷酸化(p)-NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白(IκBα)、p-IκBα、β-actin一抗、山羊抗鼠IgG(H+L)二抗(英國Abcam公司)。

1.3方法

1.3.1AGS細胞培養 AGS細胞接種于F12K培養基(含10% FBS)中培養(37 ℃,5%CO2),70%～80%濕度培養箱中培養,換液間隔天數:2～3 d,傳代(密度達80%)后用于研究(對數期細胞)。

1.3.2分組與干預 將AGS細胞(密度:2×105個/mL)分為對照組和不同水平阿奇霉素組。對照組不進行干預,不同水平阿奇霉素組分別加12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL阿奇霉素,干預24 h。用CCK-8檢測細胞活力,篩選最適水平用于后續實驗。細胞分組:對照組、阿奇霉素組、陽性藥物組、抑制劑組和激活劑組。阿奇霉素組:加入50.0 μg/mL阿奇霉素;陽性藥物組:加入50.0 μg/mL 5-氟尿嘧啶;抑制劑組:在50.0 μg/mL阿奇霉素的基礎上加入1.0 μmol/L NF-κB通路抑制劑BAY11-7082;激活劑組:在50.0 μg/mL阿奇霉素基礎上加入1.0 μmol/L NF-κB通路激活劑Prostratin。每組設3次重復,置培養箱,37 ℃,5%CO2條件下培養24 h后進行各項指標測定。

1.3.3CCK-8測定AGS細胞活力 取24 h細胞,參照CCK-8說明書進行操作,反應完成后檢測各孔吸光度(A)值(450 nm處),計算細胞活力。細胞活力為各水平阿奇霉素組A值與對照組A值的百分比。

1.3.4ELISA測定AGS細胞上清液中的炎癥因子水平 取各組細胞上清液,按照ELISA試劑盒說明書測定細胞上清液中的炎癥因子[白細胞介素-10(IL-10)、白細胞介素-1β(IL-1β)]水平。

1.3.5EdU法測定AGS細胞的增殖率 取培養24 h的細胞,具體步驟參照EdU說明書操作處理,處理完成后裝片、拍照(熒光顯微鏡)、處理圖片(Image-J 1.8.0軟件)。紅色細胞占藍色細胞的百分比即為增殖率。

1.3.6Hoechst33258法測定AGS細胞凋亡率 用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次(5分/次),固定(0.5 mL,4%多聚甲醛)10 min。PBS清洗3次(5分/次),染色(Hoechst33258染色液,5 mg/L)10 min,PBS清洗3次(5分/次),封固后觀察(熒光顯微鏡),拍照(隨機3個視野),計算凋亡率(Image-J軟件)。正常細胞:細胞核為淡藍色,形態清晰;凋亡細胞:細胞核染色不均,亮藍色,熒光較強。凋亡率為凋亡細胞數占總細胞數的百分比。

1.3.7蛋白免疫印跡(WB)法檢測AGS細胞中PCNA、Caspase-3和NF-κB信號通路關鍵蛋白表達水平 收集處理后的細胞,在冰上裂解并收集上清液。提取蛋白進行定量,上樣后進行凝膠電泳分離蛋白,后經聚偏二氟乙烯膜轉印電泳、封閉、一抗孵育、二抗孵育及膜顯色。在凝膠成像系統上采集蛋白條帶并用系統配備的分析軟件進行蛋白灰度值(G)分析。以β-actin為內參,蛋白表達水平為目標蛋白與內參蛋白的比值。p-NF-κB p65/NF-κB p65為p-NF-κB p65蛋白表達水平與NF-κB p65蛋白表達水平的比值,p-IκBα/IκBα為p-IκBα蛋白表達水平與IκBα蛋白表達水平的比值。

2 結 果

2.1阿奇霉素對AGS細胞活力的影響 對照組,以及12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL阿奇霉素組的細胞活力分別為(100.63±5.72)%、(92.93±2.02)%、(88.80±4.04)%、(69.43±4.85)%、(70.94±3.97)%。不同水平(12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL)阿奇霉素組較對照組AGS細胞活力降低,但在12.5 μg/mL時的細胞活力比較,差異無統計學意義(P>0.05),而在25.0、50.0、100.0 μg/mL的細胞活力比較,差異有統計學意義(P<0.05),其中AGS細胞活力在50.0 μg/mL的阿奇霉素處理后的抑制效果最好,所以選擇50.0 μg/mL阿奇霉素作為最適水平用于后續實驗。

2.2各組AGS細胞上清液中的炎癥因子水平比較 與對照組比較,阿奇霉素組和陽性藥物組細胞上清液中的IL-1β水平下降(P<0.05),IL-10水平上升(P<0.05);與阿奇霉素組比較,抑制劑組IL-1β水平下降(P<0.05),IL-10水平上升(P<0.05);與阿奇霉素組比較,激活劑組AGS細胞IL-1β水平上升(P<0.05),IL-10水平下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組AGS細胞炎癥因子水平比較

2.3各組AGS細胞增殖能力比較 對照組、阿奇霉素組、陽性藥物組、抑制劑組、激活劑組的AGS細胞增殖率分別為(32.75±2.32)%、(16.78±0.75)%、(16.05±0.36)%、(7.82±1.43)%、(30.20±2.18)%。結果顯示,與對照組比較,阿奇霉素組和陽性藥物組AGS細胞增殖率下降(P<0.05);與阿奇霉素組比較,抑制劑組AGS細胞增殖率下降(P<0.05),激活劑組AGS細胞增殖率上升(P<0.05)。見圖1。

圖1 EdU法檢測AGS細胞增殖能力(×20)

2.4各組AGS細胞凋亡能力比較 對照組、阿奇霉素組、陽性藥物組、抑制劑組、激活劑組的AGS細胞凋亡率分別為(3.62±0.15)%、(10.58±0.65)%、(11.37±0.97)%、(23.16±1.72)%、(5.05±0.52)%。對照組:細胞大小均勻、形態清晰、彌散均勻,細胞核呈淡藍色;其他各實驗組:細胞核呈亮藍色、染色不均、體積濃縮/變小,熒光較強。量化后發現,與對照組比較,阿奇霉素組和陽性藥物組AGS細胞凋亡率上升(P<0.05);與阿奇霉素組比較,抑制劑組AGS細胞凋亡顯著上升(P<0.05),而激活劑組AGS細胞凋亡率下降(P<0.05)。見圖2。

圖2 Hoechst 33258染色法測定AGS細胞凋亡情況(×20)

2.5各組AGS細胞PCNA和Caspase-3表達水平比較 與對照組比較,阿奇霉素組和陽性藥物組AGS細胞PCNA表達水平下降(P<0.05),而Caspase-3表達水平上升(P<0.05);與阿奇霉素組比較,抑制劑組AGS細胞PCNA表達水平下降(P<0.05),而Caspase-3表達水平升高(P<0.05),而激活劑組AGS細胞PCNA表達水平上升(P<0.05),Caspase-3表達水平下降(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 WB法檢測AGS細胞PCNA和Caspase-3表達情況

表2 各組AGS細胞PCNA和Caspase-3表達水平比較

2.6各組AGS細胞NF-κB通路蛋白比較 與對照組比較,阿奇霉素組p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα下降(P<0.05);與阿奇霉素組比較,抑制劑組p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα下降(P<0.05),而激活劑組則與抑制劑組趨勢相反(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 WB法檢測AGS細胞NF-κB通路蛋白表達情況

表3 各組AGS細胞NF-κB通路蛋白比較

3 討 論

胃癌是病死率較高的惡性腫瘤之一,但無特征性臨床癥狀,確診時患者往往已進入胃癌進展期,且目前尚無有效的診斷和治療手段。胃癌的發生是多種因素相互作用的結果,深入研究胃癌的發生、發展機制,尋找治療胃癌的關鍵靶點是目前研究的熱點[11-12]。阿奇霉素是新近發現的大環內酯類抗菌藥物,早期主要用于治療細菌感染,可在細胞中累積并緩慢釋放,相較于其他大環內酯類藥物,具有更高的局部濃度和更長的半衰期,且不良反應少,因此成為廣大學者研究的熱點。近年來,阿奇霉素在抗腫瘤方面的作用越來越被人們關注。有研究發現,阿奇霉素能抑制淋巴癌[13]和結腸癌[14]等腫瘤的惡性進程。阿奇霉素通過其抗炎作用對小兒胃炎有一定治療效果[15]。但阿奇霉素對胃癌細胞的影響尚不清楚。基于此,本研究利用不同水平(12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL)阿奇霉素干預AGS細胞,結果發現,25.0、50.0、100.0 μg/mL阿奇霉素組AGS細胞活力明顯低于對照組,其中50.0 μg/mL阿奇霉素組細胞活力最低,效果最好,因此選擇50.0 μg/mL阿奇霉素為最適水平用于后續實驗,與既往研究[13]結果相符,有一定的參考價值。為了進一步研究阿奇霉素對AGS細胞生物學行為的影響,本研究探討了阿奇霉素對炎癥細胞因子、AGS細胞增殖與凋亡的影響。結果發現,阿奇霉素干預后,IL-1β水平、AGS細胞增殖率和增殖標志物PCNA表達水平下降,而IL-10水平、凋亡率和凋亡標志物Caspase-3表達水平上升,提示阿奇霉素可抑制AGS細胞炎癥,并誘導其凋亡、抑制增殖,有良好的研究及開發前景。

NF-κB屬于二聚體轉錄因子家族,生理狀態下以NF-κB和IκBα二聚體的形式存在于細胞質中參與細胞的炎癥、增殖和凋亡等生物學過程。其異常激活后,NF-κB和IκBα二聚體在蛋白磷酸化酶的參與下發生磷酸化,二聚體NF-κB和IκBα解離,NF-κB迅速進入細胞核進行目標基因的轉錄[16]。研究發現,相關受體結合絲氨酸/蘇氨酸激酶2通過下調p-NF-κB和p-IκBα的表達水平,抑制NF-κB信號通路活性,減緩裸鼠胃癌的發展進程[17]。另有研究證實能夠通過NF-κB信號通路抑制胃癌細胞的增殖,并促進其凋亡[18]。趙朝華等[19]報道顯示,阿奇霉素不僅可以通過抑制NF-κB通路活性改善慢性阻塞性肺模型大鼠肺臟組織形態和纖維化,還可以通過抑制NF-κB信號通路促進牙周膜干細胞的成骨分化[20]。但是阿奇霉素是否可通過調控NF-κB信號通路改變胃癌的發展進程尚不十分明確。因此,本研究分析了各實驗組AGS細胞NF-κB信號通路關鍵蛋白,結果發現,阿奇霉素降低了p-NF-κB p65/NF-κB p65和p-IκBα/IκBα,說明阿奇霉素能明顯抑制NF-κB信號通路活性。在阿奇霉素的基礎上分別加入BAY11-7082和Prostratin后,BAY11-7082增強了阿奇霉素對AGS細胞的作用,Prostratin則明顯減弱了阿奇霉素對AGS細胞的作用。

綜上所述,阿奇霉素通過阻滯NF-κB通路信號轉導抑制AGS細胞炎癥和增殖,并誘導其凋亡。但是本研究僅從細胞層面研究了阿奇霉素對AGS細胞的影響,下一步可從體內水平研究阿奇霉素對胃癌的作用,為胃癌的相關治療提供更有利的參考。