GP1BA、PTGS1、LTC4S、ITGB3基因多態性檢測指導阿司匹林使用*

馮 淳,姚 楊,甄拴平,王 慧,趙家駿,王 華△

1.陜西省寶雞市中醫醫院檢驗科,陜西寶雞,721001;2.陜西省寶雞市婦幼保健院生殖醫學中心,陜西寶雞 721004;3.陜西省寶雞市中醫醫院心內科,陜西寶雞 721001

心腦血管缺血事件二級預防的主要障礙是高血小板反應(HTPR),而引起HTPR的主要原因之一為阿司匹林抵抗(AR)[1]。阿司匹林在臨床作為經典的抗血小板聚集藥物被廣泛使用[2],臨床發現部分血栓患者在服用常規劑量的阿司匹林后仍然不可避免地會再次出現血栓[3],從而引起預后不良,因而有必要對引起患者AR的影響因素進行探討,以期為臨床提供完善的藥物治療方案。血小板膜糖蛋白Ⅰbα多肽(GP1BA)基因、前列腺素內過氧化物合酶1(PTGS1)基因、白三烯C4合酶(LTC4S)基因、糖蛋白Ⅲa(ITGB3)基因的異常表達會通過活性、功能等對血小板產生影響[4-5]。本研究將回顧性分析近年在寶雞市中醫醫院接受阿司匹林抗血小板治療的患者資料,探討GP1BA、PTGS1、LTC4S、ITGB3 4種基因多態性檢測對指導臨床使用阿司匹林抗血小板治療的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2022年1月至2023年5月在寶雞市中醫醫院心內科接受阿司匹林腸溶片(拜耳醫藥保健有限公司,國藥準字J20130087)治療并進行相關基因檢測的住院患者475例,其中男322例、女153例,平均年齡(66.3±10.7)歲。在醫院信息系統收集患者相關資料并進行回顧性分析。本研究通過醫院醫學倫理委員會審批。

1.2方法 先對臨床送檢的患者全血標本進行核酸提取,然后利用聚合酶鏈反應(PCR)對目的基因進行體外擴增,最后采用飛行時間質譜儀對擴增產物中的藥物基因位點進行檢測。

全血基因組DNA提取:采集患者空腹狀態下的乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝血2 mL,利用西安天隆科技有限公司的NP968-C型全自動核酸提取儀和全血基因組DNA提取試劑盒(20T/盒)提取全血基因組DNA,并用Thermo Fisher公司的NanoDrop One檢測DNA水平,將DNA水平≥10 μg/μL的標本貯存于-20 ℃冰箱待測。

基因多態性檢測:采用浙江迪譜診斷技術有限公司的DP-TOP飛行時間質譜儀及其配套的飛行時間質譜檢測試劑(心血管藥物基因檢測試劑盒,384T/盒),嚴格按照說明書進行實驗操作,基因檢測位點主要包括GP1BA c.482C>T、ITGB3 c.176T>C、PTGS1 c.-842A>G、LTC4S c.-444A>C。抽取隨機標本對阿司匹林藥物相關4個基因位點使用Sanger測序技術進行驗證:使用4組引物對4個位點進行PCR擴增,外送至浙江尚亞生物技術有限公司進行測序。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件進行數據處理。計數資料以率或構成比表示,組間比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1飛行時間質譜平臺與Sanger測序法檢測結果比較 分別利用飛行時間質譜儀與一代測序儀,抽取隨機樣本進行阿司匹林藥物相關4個基因位點檢測(GP1BA c.482C>T、ITGB3 c.176T>C、PTGS1 c.-842A>G、LTC4S c.-444A>C),兩種方法檢測結果完全一致。見圖1。

2.2阿司匹林藥物相關基因型分布頻率 475例接受阿司匹林腸溶片治療的患者,藥物基因分布如表1所示,其中GP1BA c.482C>T基因型分布頻率CC>CT>TT,ITGB3 c.176T>C基因型分布頻率TT>TC>CC,PTGS1 c.-842A>G基因型分布頻率AA>AG>GG,LTC4S c.-444A>C基因型分布AA>AC>CC。

表1 阿司匹林藥物相關基因的基因型及等位基因分布頻率[n(%)]

2.3阿司匹林藥物相關等位基因分布頻率 475例患者各等位基因分布頻率見表1。各基因分布頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.4不同性別阿司匹林藥物相關基因分布情況 對322例男性患者和153例女性患者阿司匹林藥物相關基因型分別進行分析,不同性別的阿司匹林藥物相關基因型的分布頻率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 阿司匹林藥物相關基因的基因型分布與性別的關系[n(%)]

2.5不同年齡段阿司匹林藥物相關基因分布情況 將475例患者按年齡分為3組,分別為<55歲(72例)、55～70歲(218例)和>70歲(185例),發現不同年齡組的阿司匹林藥物相關基因型的分布頻率比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 阿司匹林藥物相關基因的基因型分布與年齡的關系[n(%)]

3 討 論

阿司匹林作為環氧合酶抑制劑可以通過乙酰化血小板COX-1的絲氨酸529位點,阻止花生四烯酸進入酪氨酸385處酶的催化部位,進而抑制血小板依賴性血栓素A2的形成,從而發揮抗血栓作用[6-8]。阿司匹林作為抗血小板藥物已經在心腦血管疾病一級和二級預防中廣泛使用[9],但是有5%～45%患者存在AR[10],AR發生的作用機制復雜,目前尚未完全明確,但已有報道指出AR與細胞及遺傳等因素有關[11]。

GP1BA基因編碼的血小板表面膜糖蛋白(GP1b)是由兩個二硫鍵連接的α和β亞基組成的異二聚體[12]。GP1BA作為糖蛋白抗體可以對血小板細胞膜產生針對性作用,該基因異常會影響血小板的活性、免疫性及功能等[13]。GP1b是血管性血友病因子(VWF)和α-凝血酶的主要受體,其α和β亞基可以和血小板糖蛋白Ⅸ、血小板糖蛋白Ⅴ結合形成受體復合物(GP1b-Ⅸ-Ⅴ),該復合物與VWF結合促進血小板與血管內皮下膜的黏附,并且還啟動血小板內信號傳導,促進血小板活化、止血或形成血栓[14]。研究發現GP1BA基因145Thr突變為Met(即5792C>T)后對阿司匹林敏感性增強,AR發生風險降低[15]。本研究結果顯示,475例患者中,CC基因型429例(90.32%)、CT基因型46例(9.68%),等位基因C占95.16%、T占4.84%,表明GP1BA基因在本地區人群中大多數為野生純合型CC,即AR風險增加,臨床應該關注患者GP1BA基因型進而實現精準用藥治療。

ITGB3是一種跨膜糖蛋白受體,存在于血小板和巨核細胞表面,有調節細胞黏附、凋亡、遷移和介導細胞與胞外基質連接的功能[16],ITGB3可以誘導血小板生成素活化,激活造血干細胞(HSC)并維持其活性,促進血小板合成,當血小板受到活化刺激后,GPⅡb/Ⅲa復合物就會發生空間構型改變從而暴露纖維蛋白原受體結合部位,促進血小板聚集[17]。GPⅡb/Ⅲa是血小板、血栓形成的共同通路,然而不同個體血小板表面受體表達存在差異,尤其是ITGB3基因突變后會導致AR。ITGB3基因rs5981(P1A)單核苷酸多態性與AR有關,基因突變后引起藥效下降甚至無應答[18]。本研究中,ITGB3基因TT型有469例,占98.74%,TC型有6例,占1.26%,說明該基因位點在本地區人群中大多數是阿司匹林低抵抗型,對于少數藥物高抵抗者建議臨床選用不受ITGB3基因多態性影響的抑制血小板藥物,如血栓通等。

PTGS1活性部位第530位絲氨酸乙?；笠种苹ㄉ南┧崤c乙酰位點結合,進而阻止血栓素A2合成,這是阿司匹林發揮抗血小板聚集作用的機制之一[19-20]。PTGS1單核苷酸多態性對其蛋白構象有所影響,其通過引起啟動子連接部位變化及氨基酸替換,影響內顯子和外顯子功能,進而使其對阿司匹林產生抑制作用。PTGS1基因突變會催化前列腺素I2生成異常,導致血管收縮、血小板聚集,進而影響阿司匹林治療效果[21-22]。本研究的475例患者中,AA基因型占98.95%,AG基因型占1.05%,說明本地區PTGS1基因突變率較低,但是單基因單核苷酸突變并不足以說明體內整個藥物代謝過程,還應該對藥物代謝過程中的其他基因從整體過程全面研究。

LTC4S是半胱酰白三烯合成通路中的關鍵酶,半胱酰白三烯廣泛參與多種炎癥病理過程,是很強的炎癥介質,半胱氨酰白三烯能激活半胱酰白三烯受體1和受體2,改變內皮細胞通透性以及影響血管內皮細胞的遷移,介導平滑肌痙攣、微血管滲透等。LTC4S c.-444A>C突變會增加冠狀動脈的鈣含量及頸動脈內膜厚度,該基因位點突變在動脈粥樣硬化形成過程中起重要作用[23]。研究表明LTC4S基因-1072AA可以增加腦血管的患病風險,相反444CC可以降低腦血管患病風險[24]。本研究發現LTC4S基因CC型僅占1.89%,C等位基因頻率為15.58%,說明本地區人群中低風險基因型占比很少,所以應該以基因檢測作為精準診療的基礎。

本研究針對本地區阿司匹林藥物相關4種基因進行了分型,發現基因存在一定的差異進而會導致藥物代謝的個體化差異。因此,對患者進行藥物基因檢測可以為臨床醫生對患者使用阿司匹林進行相關治療提供輔助性指導,具有重要的臨床價值。而且本研究所涉及的阿司匹林藥物相關4個基因的多態性分布與楊公強[25]報道的棗莊地區相關基因分布相似,但與劉少波等[26]報道的東莞地區以及錢劍寧[27]報道的肇慶地區基因分布有所不同。阿司匹林藥物相關的這4種基因分布是否具有南北方差異需要進一步開展相關基因型分布的地區與種族差異性研究,并建立本地區相關基因數據庫,為本地區的精準診療、精準用藥提供參考。人體內藥物代謝過程較為復雜,后續也需要更加完整、全面的關鍵基因來解釋個體化用藥差異,為精準醫療提供理論基礎。

致謝:浙江迪譜診斷技術有限公司朱雨晨女士對本文提供的幫助。