慢性牙周炎患者齦溝液miR-155、miR-21水平及其臨床意義*

郭嬌嬌,盧麗先,鞏蘭平,張學強,李 蕾,劉英奇

河北省邯鄲市中心醫(yī)院口腔科,河北邯鄲 056001

慢性牙周炎(CP)是由長期存在的牙齦炎向深部牙周組織擴展而導致的最常見的一類牙周炎,其主要的病理改變?yōu)檠乐艽纬珊脱啦酃俏?嚴重者會造成牙齒脫落[1]。CP好發(fā)于35歲以上人群,發(fā)病較慢、病程較長,是成年人牙齒缺失的主要原因[2]。研究顯示,CP不僅危害口腔健康,其中的致病菌還會進入人體循環(huán)系統(tǒng),可對全身多系統(tǒng)產生不良影響[3]。微小RNA不僅調節(jié)細胞代謝、分化、凋亡等活動,還調節(jié)炎癥反應,部分微小RNA參與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展[4]。研究顯示,微小RNA-155(miR-155)已被證實在牙周炎患者唾液中表達上調[5]。此外,侵襲性牙周炎患者齦溝液、CP患者唾液中均檢測到微小RNA-21(miR-21)的異常高表達,并且與牙周指標以及炎癥因子水平呈正相關[6-7]。因此,推測miR-155和miR-21可能與CP患者臨床療效有關。本研究旨在檢測miR-155、miR-21在CP患者齦溝液中表達變化,分析其與牙周炎嚴重程度、臨床療效的關系,有助于改善預后。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年10月至2022年10月到本院就診的142例CP患者作為CP組,其中男81例、女61例,年齡35～70歲、平均(53.21±7.39)歲,體質量指數(BMI)為(23.39±3.17)kg/m2;另選取同期本院142例健康志愿者作為對照組,其中男74例、女68例,年齡35～70歲、平均(52.73±6.23)歲,BMI為(23.44±2.83)kg/m2。兩組性別、年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例納入標準:符合《牙周病學》中CP相關診斷標準[8];女性患者未處于妊娠期、哺乳期、月經期;病歷資料及隨訪資料完整。病例排除標準:合并全身系統(tǒng)性疾病,如糖尿病、高血壓;1年內進行過正畸、手術或牙周治療;牙頸部有充填體、齲損;3個月內有免疫調節(jié)劑、抗菌藥物、非甾體消炎藥、激素類、阿司匹林等使用史;3個月內患急性感染疾病。本研究方案獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準(審批號:20201293),所有研究對象或家屬知情研究內容并自愿簽署同意書。

1.2方法

1.2.1牙周臨床指標檢查 由同一位口腔醫(yī)師對各組研究對象進行除第三磨牙以外的全口牙周情況檢查,并記錄以下指標:附著喪失(AL)、牙齦指數(GI)、牙槽骨吸收程度(ABL)、探診深度(PD)。每顆牙選擇頰、舌側正中、近中、遠中處檢測6個位點,最后取平均值。

1.2.2CP組牙周炎嚴重程度分組標準[9]結合AL、GI、PD及ABL檢測結果,根據牙周炎嚴重程度將CP患者進一步分組。輕度CP組:AL為1～2 mm,PD<4 mm,GI>1,牙槽骨ABL<根長1/3,牙無明顯松動,牙齦有炎癥,探診出血;中度CP組:2 mm1,根長1/3≤ABL≤根長1/2,牙出現輕度松動,牙齦有炎癥,探診出血,可有膿液;重度CP組:AL>4 mm,PD>6 mm,GI>1,牙槽骨ABL>根長1/2,牙出現多處松動,牙齦有嚴重炎癥或牙周膿腫。

1.2.3齦溝液的采集及miR-155、miR-21表達水平檢測 對照組于體檢時,CP組于入院當天采集齦溝液。將3號Whatman濾紙裁成適中大小,并消毒,將每3張濾紙條放入1個EP管中,稱質量。于受試者頰側近中、頰側遠中、舌側近中、舌側遠中采集,用無菌棉簽將取樣部位清理干凈,氣槍吹干牙面,取無菌濾紙插入牙周袋底或齦溝袋內,30 s后取出(注意避免血液或唾液污染)放在EP管中,密封,稱質量,貯存于-80 ℃環(huán)境中。所得質量差按比例1 mg/μL換算成體積。檢測時先在冰上解凍,然后加入1 mL磷酸鹽緩沖液,震蕩、離心后取上清液進行RNA的提取。使用EasyPure?微小RNA試劑盒(貨號R8106,廣州捷倍斯生物科技有限公司)從齦溝液中得到微小RNA,然后按照反轉錄試劑盒(貨號D1801,哈爾濱新海基因檢測有限公司)說明書將其反轉錄為cDNA,采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)試劑盒(貨號638316,Takara公司)在7500 Fast Real-Time PCR儀器上檢測。以U6為內參,使用2-ΔΔCt法計算miR-155、miR-21的表達水平。引物均由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。miR-155上游引物序列5′-GGGCCTTCCCTGGAACAGGAGTCT-3′,下游引物序列5′-GGGAGATTCATGGTATCAAGCACCC-3′;miR-21上游引物序列5′-GCCCGCTAGCTTATCAGACTGATG-3′,下游引物序列5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;U6上游引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4治療方法 所有入組CP患者均給予牙周基礎治療:對其進行口腔衛(wèi)生宣教;協助患者掌握Bass刷牙法及牙線工具使用方法,保持口腔清潔;拔除無功能的齲齒;采用超聲齦上潔治器去除齦上牙石,1周后檢查牙周,對PD≥4 mm以上位點進行齦下刮治和根面平整;過氧化氫或生理鹽水沖洗牙周袋,齦袋內予以碘甘油。CP組患者從治療之日起經電話、門診復查或住院隨訪1個月。

1.2.5療效判定標準[10]顯效為牙周袋深度<2 mm,患者齦溝、牙根出血情況完全消失,咀嚼功能正常;有效為牙周袋深度2～3 mm,齦溝及牙根出血消失,咀嚼功能顯著改善,牙齒松動度降低;無效為牙周袋深度、齦溝及牙根出血癥狀無改善甚至加重。將顯效患者和有效患者歸為療效良好組,將無效患者歸為療效較差組。

2 結 果

2.1兩組齦溝液miR-155、miR-21表達水平及牙周臨床指標比較 CP組齦溝液miR-155、miR-21表達水平明顯高于對照組(P<0.05),PD、AL、ABL、GI均高于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組齦溝液miR-155、miR-21表達水平及牙周臨床指標比較

2.2CP組不同牙周炎嚴重程度患者一般資料及齦溝液miR-155、miR-21表達水平比較 CP組患者分為輕度CP組49例、中度CP組53例、重度CP組40例。輕度CP組、中度CP組和重度CP組的性別、年齡、BMI比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與輕度CP組相比,中度CP組、重度CP組齦溝液miR-155、miR-21表達水平明顯升高(P<0.05);與中度CP組相比,重度CP組患者齦溝液miR-155、miR-21表達水平明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 CP組不同牙周炎嚴重程度患者一般資料及齦溝液miR-155、miR-21表達水平比較或n/n)

2.3CP組miR-155、miR-21表達水平與牙周臨床指標的相關性 Pearson相關分析結果顯示,CP組患者miR-155表達水平分別與ABL、PD、AL、GI呈正相關(r=0.594、0.728、0.675、0.632,P<0.05);miR-21表達水平分別與ABL、PD、AL、GI呈正相關(r=0.620、0.695、0.736、0.574,P<0.05)。

2.4CP組不同療效患者一般資料及齦溝液miR-155、miR-21表達水平比較 根據療效判定標準,分為療效良好組111例,療效較差組31例。與療效良好組相比,療效較差組齦溝液miR-155和miR-21表達水平升高,PD、AL、ABL、GI以及病情嚴重程度為重度患者的比例明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),兩組間性別、年齡、BMI、吸煙情況、飲酒情況、刷牙情況、偏側咀嚼情況比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 CP組不同療效患者一般資料及齦溝液miR-155、miR-21表達水平比較[n或

2.5影響CP患者療效的多因素Logistic回歸分析 以CP患者臨床療效為因變量(療效良好=0,療效較差=1),以單因素分析中差異有統(tǒng)計學意義的變量為自變量,由于病情嚴重程度與AL、GI、PD及ABL存在多重共線性(VIF=12.351、14.762、11.467、10.976),因此僅納入病情嚴重程度(輕度=0,中度=1,重度=2),以及miR-155(實測值)、miR-21(實測值)為自變量。多因素Logistic回歸分析結果顯示,病情嚴重程度、miR-155、miR-21是CP患者療效的影響因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響CP患者療效的多因素Logistic回歸分析

2.6miR-155、miR-21對CP患者療效的預測價值 ROC曲線分析結果顯示,miR-155、miR-21預測CP患者療效較差的曲線下面積(AUC)分別為0.937(95%CI:0.888～0.986)、0.818(95%CI:0.715～0.921),miR-155聯合miR-21預測CP患者療效較差的AUC為0.960(95%CI:0.920～0.998),略優(yōu)于miR-155單獨預測(Z=1.375,P=0.169),明顯優(yōu)于miR-21單獨預測(Z=2.895,P=0.004)。見圖1、表5。

圖1 齦溝液miR-155、miR-21預測CP患者療效的ROC曲線

表5 齦溝液miR-155、miR-21預測CP患者療效的效能

3 討 論

CP是一種細菌感染引起的炎癥性疾病,伴有牙周袋的形成、牙周支持組織的逐漸破壞,嚴重者會發(fā)生牙齒松動甚至脫落[11-12]。據報道,牙周炎是由革蘭陰性菌(如牙齦卟啉單胞菌)形成的微生物菌斑積聚引起,這些細菌含有的脂多糖(LPS)會激活Toll樣受體(TLR),進而導致核轉錄因子-κB(NF-κB)的激活,誘導趨化因子和促炎性細胞因子的分泌,導致炎癥發(fā)生[13]。牙周炎患者口腔中的細菌和內毒素容易傳播到血液中,從而導致全身炎癥和纖維蛋白沉積,最終對機體造成損傷[14-15]。

既往研究顯示,miR-155在炎癥反應、自身免疫性疾病中發(fā)揮作用[16-17]。miR-155還可以通過抑制干擾素(IFN)-γ分泌來抑制輔助性T淋巴細胞(Th)2分化,上調促炎性細胞因子NF-κB、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IFN-β表達,促進病原體的侵入,對免疫系統(tǒng)產生負反饋[18-19]。有研究發(fā)現miR-155的異常表達在牙周損傷中起著至關重要的作用[5]。本研究中,CP組齦溝液miR-155表達水平升高,表明CP患者中miR-155呈高表達,其異常表達可能參與疾病進展。此外,有研究報道,miR-155在糖尿病伴牙周炎患者唾液中表達水平明顯高于牙周炎患者、糖尿病患者、健康對照者[20]。另有學者發(fā)現,CP患者血清中miR-155表達水平與炎癥細胞因子白細胞介素(IL)-6、TNF-α呈明顯正相關[21]。本研究中CP患者齦溝液miR-155表達水平隨牙周炎嚴重程度增加而上升,與以往研究一致[20]。推測高水平miR-155通過促進炎癥細胞因子分泌,激活NF-κB,參與牙周炎進展。易志鋼等[22]研究表明,外周血miR-155預測狼瘡性腎炎合并肺部感染患者預后不良的AUC為0.843,監(jiān)測miR-155表達水平變化對于判斷患者預后有一定價值。目前有關miR-155表達水平變化與CP臨床療效關系的研究還較少。本研究結果顯示,療效較差組miR-155表達水平高于療效良好組,且miR-155是療效的影響因素,提示miR-155與CP患者臨床療效密切相關,其表達水平越高,患者預后越差。因此,推測miR-155對CP患者療效判斷具有一定的前瞻性。ROC曲線分析結果顯示,miR-155預測CP患者療效較差的AUC為0.937,提示miR-155對臨床療效有一定預測價值。

miR-21在多種炎癥性疾病中異常表達,其表達上調能夠促進促炎性細胞因子產生而加重組織炎癥[23]。有研究發(fā)現miR-21對LPS刺激下的巨噬細胞炎癥反應、脂質積累的促進作用通過TLR4/NF-κB信號通路實現,miR-21過表達可以加重神經炎癥損傷[24]。本研究中CP組miR-21表達水平高于對照組,提示miR-21參與CP的發(fā)生、發(fā)展。近期有學者發(fā)現,miR-21在牙齦假單胞菌LPS刺激的巨噬細胞中上調表達,并促進促炎性細胞因子的分泌,而上調miR-21后,促炎性細胞因子水平增加,同時促進NF-κB的激活[25]。本研究發(fā)現齦溝液miR-21表達水平隨牙周炎嚴重程度增加而上升,推測高水平miR-21通過促進促炎性細胞因子分泌并激活TLR4/NF-κB信號通路參與CP疾病的進展。因此,miR-21在牙周炎中具有促炎功能,可能是控制CP疾病進展的干預靶點。本研究結果顯示,療效較差患者齦溝液miR-21表達水平高于療效良好患者,推測療效較差患者機體促炎性細胞因子水平較高,機體炎癥反應嚴重,因此miR-21表達水平升高。多因素Logistic回歸分析結果顯示,miR-21是CP患者療效的影響因素,提示miR-21水平異常高表達參與CP患者病情進展,并可影響預后。有研究顯示,miR-21診斷慢性阻塞性肺疾病的AUC為0.844,檢測其表達有利于臨床診斷該疾病及判斷病情嚴重程度[26]。故檢測血清miR-21表達水平對預測CP患者療效具有重要意義。本研究進一步分析了miR-21單獨及聯合miR-155對CP患者療效的預測價值。ROC曲線分析結果顯示,miR-21及二者聯合預測CP患者療效較差的AUC分別為0.818、0.960,聯合檢測的AUC優(yōu)于單一指標,同時在不降低特異度的前提下,聯合檢測能顯著提高靈敏度,降低漏診率,有助于早期預測CP患者預后情況,這說明miR-155、miR-21有作為預測CP患者療效的生物標志物的潛能,有助于指導臨床工作。

牙周指數(ABL、GI、PD、AL)能夠反映牙周炎病情,其與炎癥程度呈正相關。羅業(yè)姣等[7]發(fā)現,慢性牙周炎患者唾液miR-21表達水平與臨床指標(GI、PD、AL)呈正相關。WU等[5]發(fā)現牙周炎患者唾液中miR-155的異常高表達與牙周病嚴重程度呈正相關,與GI、AL、PD呈正相關。本研究相關性分析結果顯示,miR-155、miR-21表達水平均與ABL、GI、PD、AL呈正相關,結合miR-155、miR-21與CP組患者牙周炎疾病嚴重程度有關這一推論,提示齦溝液中miR-155、miR-21異常高表達可能是CP炎癥進展的機制之一,但具體機制仍有待后續(xù)明確。

綜上所述,CP患者齦溝液中miR-155和miR-21均呈高表達,與牙周炎嚴重程度、牙周指標及臨床療效有關,miR-155聯合miR-21或可成為預測CP患者療效的血清標志物。然而,本研究納入病例少,仍需要擴大樣本量對結果進行驗證,以及結合細胞模型或動物模型探討miR-155和miR-21的具體作用機制。