定向引入N-糖基化位點促進芳基醇氧化酶熱穩定性及底物親和力

曹查，朱作華，龔文兵，周映君，謝純良，彭源德

（中國農業科學院 麻類研究所，湖南 長沙 410205）

芳基醇氧化酶是一種特殊的黃素過氧化物酶，具有廣泛的底物特性，能夠氧化非酚芳香醇類，包括苯甲基、萘基、苯丙烯醇和脂肪族的多不飽和醇等，生成相應的醛類物質，醛類物質再緩慢氧化成酸，在木質素降解和芳香族污染物處理領域具有重要的應用價值[1-2]。酶的高效、大量表達是推動其應用的前提[3-5]。由于野生型真菌的木質素降解酶合成效率普遍較低，且木質素降解酶的合成常需要毒性芳香化合物誘導，致使發酵液后期的處理難度大、生產成本高且容易導致環境污染[6-8]。

分子生物學技術的高速發展能夠為木質素降解酶遺傳物質實現異源大量表達提供一定的基礎[9-11]。到目前為止，刺芹側耳（Pleurotuseryngii）原位表達系統尚未建立，在眾多表達體系中，巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）作為一種安全、高效的表達宿主，具有高密度培養和翻譯后修飾等優點[12]。因此，將芳基醇氧化酶基因在畢赤酵母中表達可以促進該酶的實際工業化生產和應用。目前，P.eryngii芳基醇氧化酶基因在畢赤酵母表達系統中成功得到表達[13-14]。與原生真菌酶相比，異源重組表達的酶存在比活力、熱穩定性和底物親和力降低的問題[5]。因此，如何提高異源表達芳基醇氧化酶的比活力和熱穩定性等酶學性質成為酶制劑制備過程中亟需解決的關鍵問題。

N-糖基化修飾能夠有效調節蛋白質活力和穩定性[15-17]。N-糖基化修飾還能夠使磷酸酶具有更強的抗胃蛋白酶降解能力[18]。Yang 等[19]通過對畢赤酵母表達根瘤菌脂肪酶的熱穩定性分析發現，含有更多N-聚糖的脂肪酶更具耐熱性。研究表明，4 種選定的漆酶經糖苷內切酶H 和N-糖酰胺酶F 對進行去糖基化處理后，它們對鄰苯二酚和2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽兩種底物的親和性變得基本相同[20]。Ma 等[21]對5 種具有單一N-糖基化位點突變的突變體進行了熱穩定性測試、三維建模、動力學數據和二級結構分析，發現其中4 個位點的N-糖基化通過微調β-夾心結構域的結構型，正向調節底物親和力從而引起酶活性的改變。Xu 等[22]通過比較不同漆酶突變體的催化性能，發現rLcc9 中N313 和N454 位點的糖基化會分別影響其對底物的結合親和力和催化速率。此外，糖基化也會影響rLcc9 和nLcc9 的熱穩定性，因為這些lcc9 的去糖基化在一定程度上降低了它們的熱穩定性。但是芳基醇氧化酶N-糖基化位點、糖基化程度、蛋白構象與酶學性質之間的關系尚不清楚，限制了利用糖基化工程對芳基醇氧化酶的酶學性質進行提升。目前，通過糖基化改造提高畢赤酵母重組表達芳基醇氧化酶活力和穩定性未見報道。本文以木質素高效降解菌株P.eryngii分泌的芳基醇氧化酶作為研究對象，分析天然狀態與重組表達芳基醇氧化酶N-糖基化修飾的特征與差異，闡明N-糖基化調控芳基醇氧化酶催化性質的分子機制，以期獲得高活力、高穩定性芳基醇氧化酶。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

畢赤酵母GS115（P.pastorisGS115）：美國Invitrogen 公司；刺芹側耳（P.eryngii，編號CICC 50126）：中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 材料、試劑和培養基

快流速DEAE-瓊脂糖凝膠柱（DFF100）：美國Sigma-Aldrich 公司；丙烯葡聚糖凝膠S-200 HR、Source 15Q：上海澤葉生物科技有限公司；限制性核酸內切酶、T4 連接酶、核酸膠回收試劑盒、DNA Marker：大連Takara 生物技術公司；質粒提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；博來霉素：上海碧云天生物技術公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物：北京擎科生物科技有限公司；BMGY 液體培養基、BMMY 培養基：青島日水生物技術有限公司；甲醇、胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、瓊脂粉、山梨糖醇：美國Sigma 公司。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar medium，PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：胰蛋白胨20.0 g/L，酵母提取物10.0 g/L，瓊脂粉20.0 g/L。

YPD 山梨糖醇（yeast extract peptone dextrose sorbitol medium，YPDS）+博來霉素平板：葡萄糖20.0 g/L，胰蛋白胨20.0 g/L，酵母提取物10.0 g/L，山梨糖醇182 g/L，博來霉素0.1 g/L，瓊脂粉20.0 g/L。

1.2 用于定點突變的芳基醇氧化酶N-糖基化位點篩選及確定

以已經公布的芳基醇氧化酶蛋白三維晶體結構為模板，利用SWISS-MODEL 對其結構進行模擬。經過N-糖基化在線搜索引擎Net Glyc1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）對潛在的芳基醇氧化酶N-糖基化位點進行預測。根據質譜鑒定結合生物信息學分析選取目標突變糖基化位點。在上述芳基醇氧化酶上將關鍵位點進行單點或多點突變，將芳基醇氧化酶N89 和N249 號糖基化中的天冬酰胺（asparagine，Asn）突變成丙氨酸（alanine，A），構建3 個突變體（N89A、N249A、N89/249A）。為了提高糖基化修飾的發生率，可將其構成增強芳香族序列（enhanced aromatic sequence，EAS）的形式。目標突變序列主要關注那些較少氨基酸的突變就能導致EAS 序列形成的氨基酸序列，因此糖基化較高的loop/turn 區上的氨基酸序列比較合適。采用PyMOL 軟件的方式，在三維結構晶體上，對目標突變位點的所處位置進行初步分析，最后得出該序列在蛋白質三維結構表面上，而且遠離活性位點，且處于loop/turn 區的位置。根據以上原則，突變體表達如下：AAO（F-X-N-X-T），AAO（F-N-X-T）和AAO（F-X-X-N-X-T）。

1.3 P.eryngii 芳基醇氧化酶野生型和突變體的酵母表達載體構建

雙酶切含有野生型及突變體基因質粒后，PCR 產物經1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行膠回收純化和T 載體連接。采用CaCl2法制備大腸桿菌DH5α 感受態。將10 μL 的連接產物加到感受態細胞中，進行轉染和菌落PCR 鑒定，出現目的條帶的菌種，進行測序分析。目的基因陽性菌種經過鑒定正確之后，對其采取復蘇培養處理，對重組質粒進行處理。針對目的基因重組質粒與表達載體pPIC9K，采取雙酶切的方式，利用膠回收酶切產物，經過連接之后，實現重組表達載體的構建。連接產物轉化至大腸桿菌DH5α 中，篩選出重組菌，擴培后提取質粒并對其進行PCR 驗證和雙酶切驗證，陽性菌種測序，保存鑒定正確的目的基因重組表達菌種。

1.4 重組質粒電擊轉化畢赤酵母GS115 及其重組子的篩選

通過DNA 測序驗證突變后，對重組質粒進行單酶切線性化，將酶切產物進行膠回收。電穿孔轉化為畢赤酵母GS115 感受態細胞。隨后，在含100 μg/mL 博來霉素YPDS 平板上選擇轉化子。

轉化子進一步劃線于含G418 的YPD 平板上，28 ℃培養2 d 至單菌落出現后，轉接于10 mL BMGY液體培養基中，于30 ℃、200 r/min 搖床培養48 h，收集菌體，棄上清液；通過采用BMMY 誘導培養基，稀釋菌體直到OD600=1，在30 ℃的溫度狀態下，200 r/min 搖床培養。添加甲醇，以保證每天終濃度為0.5%（體積分數），誘導3 d 后每隔24 h 收集一次培養上清液。得到的上清液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，篩選陽性單菌落。

1.5 P.eryngii 芳基醇氧化酶分離和純化

將陽性單菌落轉接至含100 mL BMGY 液體培養基的300 mL 錐形瓶進行擴大培養72 h，轉速為3 000 r/min，離心時間5 min，收集上清液，利用35%飽和度硫酸銨，予以初次沉淀處理，在二次沉淀時，采用75% 飽和度硫酸銨將大多數雜蛋白從發酵液內去除，進而采用化學親和、離子交換法、疏水和凝膠過濾等多層析方式純化表達中的重組蛋白質，獲得較高純度的酶[14，23]，并進行后續酶活性的測定。

1.6 芳基醇氧化酶催化性質研究

1.6.1 酶活力測定

在1 mL 反應混合液體系中，藜蘆醇為10 mmol/L，而且還含有100 mmol/L（pH6.0）磷酸鈉緩沖液以及一些酶液，室溫下，于310 nm 處測定吸光度的變化（310 nm 處藜蘆醇摩爾吸光系數ε=9 300），以100 ℃加熱滅活的酶反應混合液為對照。在每毫升反應混合液內，1 μmol 產物在每分鐘需要的酶量定義為1 個酶活力單位（U）。

1.6.2 酶催化特性的測定

最適溫度：在相同pH 值反應條件和反應體系下，將重組突變酶或野生型酶與底物在不同溫度（20～80 ℃）下反應，按1.6.1 測定酶活力，確定木質素降解酶的最適反應溫度。最適pH 值：野生型酶或重組突變酶在不同pH 值（1～12）下與底物反應，采用1.6.1 方法測定酶活力，從而明確最佳反應pH 值。pH 值穩定性：分別將其混合到不同pH 值（1～12）緩沖液內，在37 ℃的溫度環境下，放置3 h，對剩余酶活力進行測定，參照標準即為最適pH 值的酶活，并使其穩定性得以明確。熱穩定性：通過調整野生型酶樣品與表達的突變體，保持一致的濃度（0.15 mg/mL），在70 ℃及以上的水浴中處理15 min，處理后立即置于冰上冷卻，在37 ℃的條件下，溫育時間為5 min，對剩余酶活進行測定，各個反應的重復次數為3 次。動力學常數：基于最適pH 值的狀態下，配制不同濃度的底物，分別表示為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L 以及1.2 g/L，取一定量的重組突變酶或野生型酶與底物在40 ℃反應10 min，進行酶活測定。利用Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法得出結果。

2 結果與分析

2.1 對芳基醇氧化酶N-糖基化位點進行生物信息學預測和結構分析

采取生物信息學預測的方式，以N-糖基化在線捜索引擎Net Glyc1.0 Server 為依托，預測分析N-糖基化位點，通過對芳基醇氧化酶進行研究后發現，在N89號和N249 號位點位置處，表現出糖基化修飾的特點。具體見圖1[24]。

2.2 突變體克隆表達

對突變體AAO（N89A）、AAO（N249A）、AAO（N89/249A）、AAO（F-X-N-X-T）、AAO（F-N-X-T）和AAO（F-XX-N-X-T）的全質粒擴增產物進行DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2 和圖3 所示。

從圖2 和圖3 中可以看出，理論PCR 產物的大小約為2 275 bp；經PCR 篩選后，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，能篩選到較多的陽性克隆菌落，初步說明定點突變成功。

2.3 小量表達測試

誘導表達各重組子之后，上清液SDS-PAGE 的結果見圖4。

圖4 SDS-PAGE 電泳分析Fig.4 The analysis for SDS-PAGE electrophoresis

由圖4 可知，各重組子均可表達相應的突變酶且表達量與野生型大致相同。芳基醇氧化酶的理論分子量為70 kDa，在畢赤酵母中表達其分子量會因發生N-糖基化而增加，故實際分子量大于70 kDa。

2.4 重組表達芳基醇氧化酶分離純化及酶活性測定結果分析

重組表達野生型芳基醇氧化酶發酵上清液經硫酸銨沉淀，對粗酶液采取重溶透析之后，根據DEAE-Sepharose Fast Flow 弱陰離子交換層析柱進行操作，Sephacryl S-200 High Resolution 凝膠過濾層析柱和Source 15Q 強陰離子交換層析柱，隨峰值檢測芳基醇氧化酶活性并收集層析產物，重組表達芳基醇氧化酶分離純化及酶活性的結果見表1。

表1 芳基醇氧化酶分離純化Table 1 Isolation and purification of aryl-alcohol oxidase

由表1 可知，經上述步驟純化后，芳基醇氧化酶比活力為221.3 U/mg，較粗酶液純化了4.6 倍，回收率為27%。通過Source 15Q 強陰離子交換層析柱繼續對6 個芳基醇氧化酶糖基化突變體進一步進行純化，進行了酶活檢測，結果如圖5 所示。

圖5 芳基醇氧化酶野生型和6 個糖基化突變體酶活檢測結果Fig.5 Results of the enzyme activity of wild type aryl-alcohol oxidase and six glycosylation mutants

由圖5 可知，與野生型相比，突變體酶活沒有明顯差異。

2.5 野生型和6 個突變體純化后芳基醇氧化酶酶學性質分析

2.5.1 pH 值對芳基醇氧化酶活性的影響

分別配制100 mmol/L pH2.0～4.5 的酒石酸鈉緩沖液、100 mmol/L pH6.0～8.0 的磷酸鈉緩沖液和100 mmol/L pH8.0～12.0 的廣泛緩沖液體系。對芳基醇氧化酶不同突變體進行酶活測定，改變緩沖體系，設定最高者的相對酶活為100%。在以上條件下，pH 值對野生型和6 個突變體芳基醇氧化酶活性的影響見圖6。

圖6 pH 值對芳基醇氧化酶酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on aryl-alcol oxidase activity

從圖6 中可以看出，以藜蘆醇為底物時，芳基醇氧化酶在pH5.0～7.0 之間顯示出較強的酶活，其中在pH值為6.0 時活力最高。如果pH 值高于8.0，將會迅速降低酶活力，如果這一數值為11.0，無法對酶活力進行檢測。同時，不同突變體的酶活力結果顯示，加入或刪除糖基化位點對芳基醇氧化酶的最適pH 值幾乎沒有影響。

2.5.2 溫度對芳基醇氧化酶活性的影響

由2.5.1 得出的最適催化pH 值的緩沖體系測定酶活力，將該緩沖體系在20～90 ℃溫度梯度下保溫10 min，設定最高者的相對酶活力為100%，緩沖體系應用的即為pH6.0。在以上條件下，溫度對野生型和6 個突變體芳基醇氧化酶活性的影響見圖7。

圖7 溫度對芳基醇氧化酶酶活力的影響Fig.7 Effect of temperature on aryl-alcol oxidase activity

從圖7 可知，突變N89 和N249 糖基化位點后，芳基醇氧化酶的最適溫度降低為60 ℃，引入新的糖基化位點后，最適溫度沒有明顯變化，同于野生型的65 ℃溫度。

2.5.3 芳基醇氧化酶的熱穩定性

將芳基醇氧化酶與最適穩定pH 值緩沖液充分混合，置于60～100 ℃溫度梯度下，保溫24 h，設定原始芳基醇氧化酶的相對活力為100%。采用pH6.0 的緩沖體系與芳基醇氧化酶的酶液混合，分別放在不同溫度的水浴鍋里保溫24 h 后測定酶活力。在以上條件下，野生型和6 個突變體芳基醇氧化酶的熱穩定性見圖8。

圖8 芳基醇氧化酶野生型和6 個糖基化突變體熱穩定性Fig.8 Thermal stability of wild-type and six glycosylation mutants of aryl-alcohol oxidase

從圖8 中可以看出，芳基醇氧化酶在60 ℃和65 ℃時，經過24 h 后仍能保持很高的活性；但隨著溫度的升高，酶活力逐漸下降，在80 ℃時，野生型酶殘余酶活力降至40% 左右；相較于野生型而言，N89 和N249 糖基化位點的突變導致了熱穩定性的降低。相反地，F-X-N-X-T、F-N-X-T 和F-X-X-N-X-T 這3 種引入了不同糖基化位點的突變體，隨著溫度的上升，相對酶活力下降的速度明顯比野生型慢，當溫度上升至80 ℃時還保留了60%左右的酶活力。

2.5.4 野生型和6 個突變體純化后芳基醇氧化酶的動力學參數

野生型和6 個突變體芳基醇氧化酶的動力學參數見表2。

表2 芳基醇氧化酶動力學參數Table 2 Kinetic parameters of aryl-alcohol oxidase

表2 結果表明，糖基化位點突變對芳基醇氧化酶比活力影響不大，但是，N89 和N249 糖基化位點突變后會影響酶和底物的親和力，突變體AAO（F-X-N-X-T）具有更高的糖基化水平，與此同時，催化效率與底物親和力也相對較高。

3 討論與結論

不同的側耳屬，煙管菌和黃孢原毛平革菌屬中都有芳基醇氧化酶表達[1]。其中P.eryngii芳基醇氧化酶研究最為廣泛[25]。吳茵等[25]從P.eryngii中獲得的純化芳基醇氧化酶分子量和等電點分別為70 kDa 和4.2。以藜蘆醇為底物進行酶活測定，最適pH 值為6.0，最適反應溫度40 ℃。同時，來自P.eryngii的芳基醇氧化酶基因分別在釀酒酵母和畢赤酵母表達系統中成功得到表達[13]。

研究表明，糖基化影響蛋白質的空間構象、酶對底物的識別催化能力及其熱穩定性[26-28]。在現代酶學研究中，糖基化逐漸成為研究者關注的熱點[29-30]。研究發現，蛋白糖基化主要有兩種形式，其一是N-糖基化，其二即為O-糖基化。相關研究表明，N-糖基化修飾可以有效調節真菌胞外分泌酶活性和穩定性。黑曲霉植酸酶phyA2 去糖基化處理后活性下降了10%[31]；對畢赤酵母重組表達的乙酰木聚糖酯酶33 號和99 號N-糖基化位點進行突變，突變體與原酶相比，在比活力上沒有明顯差別，而穩定性均有明顯的下降[32]。泡盛曲霉阿魏酸酯酶糖基化位點N79 分別定點突變為N79A 和N79Q，兩個突變體熱穩定性和酶活性明顯降低[33]。相反地，突變位于反向轉角區具有EAS 特征的位點，能顯著提高堿性果膠酶和β-葡萄糖醛酸苷酶活性和熱穩定性[34-35]。

本文以畢赤酵母GS115 為表達系統，成功表達了不同N-糖基化水平的芳基醇氧化酶突變體，對野生型和突變體蛋白進行酶學性質分析發現，突變芳基醇氧化酶N89 和N249 糖基化位點的突變導致最適溫度和酶熱穩定性降低，在酶的loop/turn 區引入具有EAS 特征的新N-糖基化，對提高其熱穩定性具有顯著促進作用。以藜蘆醇為底物時，突變體AAO（F-X-N-X-T）與底物親和力最高，其他突變體基本不變。結果表明，糖基化程度的提高與芳基醇氧化酶熱穩定性提高存在明顯的相關性，這與之前的研究相符。

經N-糖基化改造獲得的高酶活、高穩定性重組芳基醇氧化酶突變酶AAO（F-X-N-X-T）的最適反應溫度為65 ℃、最適反應pH 值為6，其最適溫度和70 ℃下的熱穩定性都明顯優于野生型。通過合適的定點突變和引入N-糖基化位點[AAO（F-X-N-X-T）]等措施對芳基醇氧化酶N-糖基化進行改造，獲得了具有高親和力、高穩定性的芳基醇氧化酶。本文為揭示N-糖基化修飾調控芳基醇氧化酶酶學性質的普遍規律，利用糖基化工程生產高品質的酶提供理論依據。