奶渣酪蛋白酸鈣的制備及在植脂末中的應用

許涌捷，劉衛震，袁延佩，王冠華，伍昌軍，隋文杰*

（1.天津科技大學 食品營養與安全國家重點實驗室，食品科學與工程學院，天津 300457；2.天津科技大學 輕工科學與工程學院，天津 300457；3.湖北百特威生物科技有限公司，湖北 仙桃 433099）

奶渣是牦牛乳提取酥油后留下的一種副產物，由提制酥油后的脫脂乳經加熱后凝固沉淀、過濾、曬干制得，呈淡黃色塊狀[1-2]。奶渣作為一種副產品，產量高并且價格低，營養豐富，富含蛋白質、乳糖、礦物質及多種維生素[3-4]。目前，奶渣相關產品的開發有限，奶渣的利用附加值較低。

酪蛋白酸鈣是一種較好的補鈣物質，其中鈣離子與酪蛋白中絲氨酸的磷酸殘基穩定結合[5]，可以被人體更好地吸收利用，并且含有豐富的賴氨酸[6]。一般純度較低的酪蛋白酸鈣產品主要用于工業制造，如造紙工業、皮革工業、乳膠工業等[7]；而純度較高的酪蛋白酸鈣因具有特定的功能性質，如增稠性、乳化性、起泡性等，故可應用于食品加工中[8]。目前，酪蛋白酸鈣的制備主要以牛奶酪蛋白為原料，國內外鮮有以奶渣為原料的制備實例，并且缺乏對酪蛋白酸鈣的理化性質及其乳化性的研究和相關應用實例的報道。因此，本文以奶渣為原料，探究奶渣酪蛋白酸鈣制備的條件、理化性質和以其作為乳化劑制備植脂末產品的穩定性，旨在為食品工業開發成本低、乳化性好的植脂末產品提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

奶渣：四川甘孜藏族自治州理塘縣；酪蛋白酸鈣：市售；谷氨酰胺轉氨酶（120 U/g）：江蘇一鳴生物股份有限公司；椰子油：文昌純椰食品有限公司；葡萄糖漿：億隆生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium lauryl sulfate，SDS）、8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、鄰苯二甲醛、Tris-甘氨酸：北京索萊寶科技有限公司；Tris-鹽酸緩沖溶液：國藥集團化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

高速離心機（H1850）：湖南湘儀有限公司；凱氏定氮儀（Kjeltec）：福特（中國）有限公司；高壓均質機（AHBASIC）：安拓思納米技術（蘇州）有限公司；紫外分光光度計（UV-6100 型）：美國尼高利儀器公司；激光粒度分析儀（C 型）：美國Sequoia Scientific 公司。

1.2 奶渣酪蛋白酸鈣的制備

參考許涌捷等[9]的方法，通過脫脂、堿溶酸沉從奶渣中提取酪蛋白，將奶渣酪蛋白與蒸餾水按照一定比例混合，不斷攪拌，水浴加熱至43 ℃，緩慢加入濃氨水至奶渣酪蛋白溶解，然后加入Ca（OH）2懸濁液攪拌，2 h后過濾除去不溶解的奶渣酪蛋白，最后經過干燥得到奶渣酪蛋白酸鈣。

1.3 單因素試驗

以pH 值、料液濃度及Ca（OH）2添加量為因素，以鈣含量為指標，分別進行單因素試驗。探究溶液pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、料液濃度（0.50%、0.75%、1.00%、1.50%、2.00%）、Ca（OH）2添加量（1.0%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%）對奶渣酪蛋白酸鈣中鈣含量的影響。

1.4 奶渣酪蛋白酸鈣理化性質的測定

1.4.1 奶渣酪蛋白酸鈣基本組分的測定

粗蛋白的測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》；粗脂肪的測定參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》；乳糖的測定參照GB 5009.8—2016《食品安全國家標準食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》；水分的測定參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》；灰分的測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》；鈣含量的測定參照GB 5009.268—2016《食品安全國家標準食品中多元素的測定》。

1.4.2 奶渣酪蛋白酸鈣乳化性的測定

參考Nishimura 等[10]的方法并稍作改動，取5 mL花生油與15 mL 待測樣品溶液，混合后均質2 min，取均質后的液體100 μL，其余液體靜置10 min，在靜置前后的液體中加入0.1% SDS 溶液稀釋，并在500 nm下測定吸光度。靜置前后的液體吸光度分別記為A0和A1，樣品乳化活力指數（emulsification activity index，EAI）和乳化液穩定系數（end system identifier，ESI）計算公式如下。

式中：X為乳化活力指數；A為樣品在500 nm 下的吸光度；C為樣品的濃度，g/mL；L為比色杯直徑，1 cm；N為稀釋倍數；Φ為油相體積分數；Y為乳化液穩定系數，%；A0為靜置前液體吸光度；A1為靜置后液體吸光度。

1.4.3 奶渣酪蛋白酸鈣交聯度的測定

參考閆爽等[11]的方法并稍作修改，稱取2 g 谷氨酰胺轉氨酶溶于水中，定容至50 mL 容量瓶中，在37 ℃下保溫30 min。取20 mL 濃度為5 mg/mL 的樣品溶液，添加3 mL 谷氨酰胺轉氨酶溶液，在47 ℃的恒溫水浴中反應120 min。反應結束后，在85 ℃的水中滅活5 min 后，稀釋至0.5 mg/mL。分別取2 mL 交聯前后的樣品溶液，各加入2 mL 鄰苯二甲醛溶液，靜置反應2 min 后，在336 nm 下測定吸光度，稀釋至0.5 mg/mL。依據公式計算樣品中游離氨基的含量和交聯度。

式中：V為游離氨基酸含量，μg/mg；Ai為樣品的吸光度；C為樣品的濃度，mg/mL；N為交聯度，%；M1為樣品交聯前游離氨基含量，μg/mg；M2為樣品交聯后游離氨基含量，μg/mg。

1.4.4 奶渣酪蛋白酸鈣起泡性和泡沫穩定性的測定

參考Wang 等[12]的方法測定起泡性，測定3 種樣品的起泡性。取1 g 奶渣酪蛋白酸鈣，加入100 mL 蒸餾水，在攪拌機中攪拌1 min，出現大量泡沫，將攪拌后的溶液移入200 mL 量筒中，泡沫體積記為V0，隨后放置30 min，再次記錄泡沫體積，記為V1。起泡性（W，%）和泡沫穩定性（S，%）的計算公式如下。

式中：V為液體總體積，mL；V0為泡沫所占的體積，mL；V1為泡沫的殘留體積，mL。

1.5 植脂末的制備

參考王濤等[13]的方法并稍作修改，分別以市售酪蛋白酸鈣、奶渣酪蛋白酸鈣、實驗室自制奶渣酪蛋白酸鈉為原料，加入椰子油、葡萄糖漿和去離子水，攪拌后經過高壓均質機均質，最后進行冷凍干燥。奶渣酪蛋白酸鈣、市售酪蛋白酸鈣和奶渣酪蛋白酸鈉制備的植脂末，分別命名為植脂末1、植脂末2 和植脂末3。

1.6 植脂末特性測定

1.6.1 貯藏穩定性測定

參考Zhang 等[14]的方法測定植脂末的粒徑和ζ-電位，考察貯藏時間對植脂末穩定性的影響。將制備的植脂末溶于水中，配制植脂末溶液，分別測定樣品于4 ℃條件下放置0、6、12、24 h 后的粒徑和ζ-電位。

1.6.2 pH 穩定性測定

參考Zhang 等[14]的方法測定植脂末的粒徑和ζ-電位，考察pH 值對植脂末穩定性的影響。將制備的植脂末溶于水中，配制植脂末溶液，取等量的植脂末溶液，分別調節pH 值至2、4、9，用激光粒度分析儀分別測定植脂末溶液在不同pH 值下的粒徑及ζ-電位。

1.6.3 溫度穩定性測定

參考Zhang 等[14]的方法測定植脂末的粒徑和ζ-電位，考察溫度對植脂末穩定性的影響。將制備的植脂末溶于水中，配制植脂末溶液，分別調整溶液的溫度為4、25、45 ℃，采用激光粒度分析儀分別測定植脂末溶液在不同溫度下的粒徑及ζ-電位。

1.7 數據處理

所有試驗均重復3 次，試驗數據采用SPSS 22.0 軟件的方差分析進行顯著性分析，利用Origin Pro 9.0 進行制圖。

2 結果與分析

2.1 奶渣酪蛋白酸鈣制備單因素試驗結果

酪蛋白單體組分含有多個磷酸絲氨酸殘基的磷酸基團，可與鈣離子結合[5]，通過加入氨水使氨根離子與酪蛋白形成水溶性鹽，然后再加入堿性較強的氫氧化鈣進行反應，形成酪蛋白酸鈣，同時保證了鈣離子與酪蛋白的充分結合，提高了鈣的結合率。

2.1.1 溶液pH 值對奶渣酪蛋白酸鈣中鈣含量的影響奶渣酪蛋白酸鈣制備時，pH 值對奶渣酪蛋白酸鈣中鈣含量的影響見圖1。

圖1 溶液pH 值對鈣含量的影響Fig.1 Effect of solution pH on calcium content

由圖1 可知，當pH 值為7.0 時，奶渣酪蛋白酸鈣中的鈣含量最高，隨著pH 值升高或降低均會造成鈣含量的損失，這可能是由于酸性條件下酪蛋白溶解度降低，而在堿性條件下，由于羧酸鹽與質子化氨基的靜電作用以及酪氨酸的羥基與羧基之間的氫鍵結合使得蛋白質的三級結構消失，降低了酪蛋白的穩定性[15]，從而不利于鈣離子與酪蛋白的結合，因此溶液pH 值選擇7.0。此結果與葛靜微等[7]探究pH 值對酪蛋白酸鈣中鈣含量影響的研究結果一致。

2.1.2 酪蛋白料液濃度對奶渣酪蛋白酸鈣中鈣含量的影響

酪蛋白料液濃度對奶渣酪蛋白酸鈣中鈣含量的影響見圖2。

圖2 料液濃度對鈣含量的影響Fig.2 Effect of feed solution concentration on calcium content

由圖2 可知，料液濃度為0.50%～1.00% 時，奶渣酪蛋白酸鈣中的鈣含量逐漸增加，料液濃度為1.00%時，奶渣酪蛋白酸鈣中的鈣含量最高，料液濃度大于1.00% 時，鈣含量逐漸降低。這可能是由于料液濃度過高時，會使原料的黏稠度過高，不利于其與鈣離子結合[7]，因此料液濃度選擇1.00%。

2.1.3 Ca（OH）2添加量對奶渣酪蛋白酸鈣中鈣含量的影響

Ca（OH）2添加量對奶渣酪蛋白酸鈣中鈣含量的影響見圖3。

圖3 Ca（OH）2 添加量對鈣含量的影響Fig.3 Effect of Ca（OH）2 addition on calcium content

由圖3 可知，隨著Ca（OH）2添加量的增加，酪蛋白酸鈣中鈣含量呈先升高后降低的趨勢。當Ca（OH）2添加到一定量時，鈣離子與酪蛋白結合達到飽和狀態，當Ca（OH）2添加量為1.6% 時，酪蛋白酸鈣中的鈣含量最高，達到1.35%，這與葛靜微等[7]探究Ca（OH）2對酪蛋白酸鈣中鈣含量影響的研究結果一致。

2.2 奶渣酪蛋白酸鈣理化性質的測定結果

2.2.1 奶渣酪蛋白酸鈣基本組分測定結果

奶渣酪蛋白酸鈣基本組分測定結果見表1。

表1 奶渣酪蛋白酸鈣基本組分Table 1 Basic components of calcium caseinate from milk residues

由表1 可知，奶渣各組分中含量最高的為粗蛋白，為64.09%。由奶渣制備的酪蛋白和酪蛋白酸鈣中的粗蛋白含量均較高，分別達到91.41%和93.76%，奶渣酪蛋白酸鈣未檢出乳糖，奶渣酪蛋白酸鈣中的粗脂肪含量低于奶渣酪蛋白，為1.37%，乳糖未檢測出，鈣含量為1.35%，奶渣酪蛋白酸鈣的粗蛋白含量和鈣含量均高于市售酪蛋白酸鈣，因此由奶渣酪蛋白制備的酪蛋白酸鈣粗蛋白含量高、純度較高。

2.2.2 奶渣酪蛋白酸鈣乳化性分析

蛋白質的乳化性質是指能使油和水形成穩定乳化液的性質[16]。由于酪蛋白分子具有親水基和親油基，在油水混合液中，酪蛋白的疏水部分偏向脂質，親水部分朝向水相，使表面張力降低，油水混合液形成穩定的體系[17-18]。奶渣酪蛋白酸鈉、奶渣酪蛋白酸鈣和市售酪蛋白酸鈣的乳化性見圖4。

由圖4 可知，由奶渣酪蛋白制備的酪蛋白酸鈣具有優異的乳化能力，ESI 高于奶渣酪蛋白酸鈉和市售酪蛋白酸鈣，ESI 達到70% 以上。這可能是由于酪蛋白與鈣離子結合，形成更穩定的膠束體系，并且由于奶渣加工過程的影響，奶渣酪蛋白的二級結構穩定性相較市售酪蛋白增強[9]，蛋白分子使得油-水界面穩定的時間延長，使得乳液在一定時間內保持其結構和狀態的能力提高[19]，因此奶渣酪蛋白酸鈣可作為性能優異的乳化劑應用于食品領域[20]。同時，奶渣酪蛋白酸鈣的乳化活力指數顯著低于市售酪蛋白酸鈣（P<0.05），這可能是由于奶渣加工過程中溫度升高，使得酪蛋白膠束內部的疏水基部分轉移到表面，從而蛋白質在油-水界面吸附形成乳狀液的能力減弱[21]。

2.2.3 奶渣酪蛋白酸鈣交聯度分析

交聯是常見蛋白改性技術之一，可改善其功能性質，從而發揮更廣泛的作用。谷氨酰胺轉氨酶可使蛋白質發生交聯，引起蛋白質分子聚集，形成更加致密的網狀結構，對外界有更強的抵抗能力，能夠改善蛋白質的穩定性[22]。兩種酪蛋白酸鈣和奶渣酪蛋白酸鈉的交聯度見圖5。

圖5 奶渣酪蛋白酸鈉、奶渣酪蛋白酸鈣和市售酪蛋白酸鈣的交聯度Fig.5 Cross-linking degree of sodium caseinate and calcium caseinate from milk residues as well as commercially available calcium caseinate

由圖5 可知，奶渣酪蛋白酸鈣的交聯度顯著低于奶渣酪蛋白酸鈉和市售酪蛋白酸鈣（P<0.05），可能是由于奶渣加工過程中對酪蛋白結構產生影響，導致蛋白質側鏈的賴氨酸及谷氨酰胺殘基發生分子內及分子間交聯時，產生的游離氨基較少。

2.2.4 奶渣酪蛋白酸鈣起泡性分析

起泡性與蛋白質能產生的界面面積的量和穩定性有關[23]，在蛋糕、面包和冰淇淋等食品加工中具有重要作用[24]。奶渣酪蛋白酸鈉、奶渣酪蛋白酸鈣和市售酪蛋白酸鈣的起泡性結果見圖6。不同大寫字母表示泡沫穩定性差異顯著（P<0.05）；不同小寫字母表示起泡能力差異顯著（P<0.05）。

圖6 奶渣酪蛋白酸鈉、奶渣酪蛋白酸鈣和市售酪蛋白酸鈣的起泡性Fig.6 Foaming properties of sodium caseinate and calcium caseinate from milk residues as well as commercially available calcium caseinate

由圖6 可知，奶渣酪蛋白酸鈣的起泡能力顯著高于奶渣酪蛋白酸鈉和市售酪蛋白酸鈣（P<0.05），達到43%，這可能是由于奶渣酪蛋白酸鈣中的蛋白質含量最高，蛋白質在經過均質后，會吸附到水-空氣界面，蛋白質分子部分展開，使得更多的空氣進入，從而在氣-液界面形成一層薄膜，并形成氣泡[25]。因此，奶渣酪蛋白酸鈣可應用于面包、啤酒等食品的加工過程中[24]。而奶渣酪蛋白酸鈣的泡沫穩定性顯著低于奶渣酪蛋白酸鈉與市售酪蛋白酸鈣（P<0.05），可能是由于奶渣加工過程中酪蛋白結構發生改變，蛋白質的分子結構會影響氣-液薄膜的穩定性，并且鈣離子使得游離酪蛋白含量減少，從而減慢在泡沫體系中形成界面膜，泡沫體系的黏度降低[5]。

2.3 植脂末穩定性分析

2.3.1 植脂末貯藏穩定性分析

3 種植脂末粒徑隨貯藏時間的變化見圖7。

圖7 3 種植脂末粒徑隨貯藏時間變化Fig.7 Variation of particle size of the three non-dairy creamers with storage time

由圖7 可知，3 種植脂末在放置24 h 后粒徑分布發生變化，粒徑均變大，奶渣酪蛋白酸鈣制備的植脂末1 在放置12 h 和24 h 后粒徑變化最小，穩定性最好。

3 種植脂末乳液ζ-電位隨儲藏時間的變化見圖8。

圖8 3 種植脂末ζ-電位隨儲藏時間變化Fig.8 Variation of ζ-potential of the three non-dairy creamers with storage time

由圖8 可知，隨儲藏時間的延長，3 種植脂末的ζ-電位在24 h 時出現小范圍下降，由奶渣酪蛋白酸鈣制備的植脂末1 乳液電位值變化最小，且ζ-電位最高，粒子間排斥力越大[26]。這是由于奶渣酪蛋白酸鈣的ESI高于奶渣酪蛋白酸鈉和市售酪蛋白酸鈣，當其作為乳化劑制備植脂末時，酪蛋白酸鈣分子在油-水界面的吸附性增強，可以更充分地與油相結合，同時由于附近蛋白可以在溶液表面形成薄膜[5]，使得界面張力降低，乳濁液更穩定[27]。

2.3.2 植脂末pH 穩定性分析

植脂末1、植脂末2 和植脂末3 在不同pH 值下隨時間的延長粒徑和ζ-電位變化見圖9。

圖9 3 種植脂末粒徑和ζ-電位值變化Fig.9 Variation of particle size and ζ-potential of the three non-dairy creamers with pH

由圖9A～圖9C 可知，3 種植脂末在pH2 和pH4時，隨著時間的延長，植脂末乳液的粒徑變化較大，在pH9 時，植脂末乳液的粒徑變化較小，乳液最穩定，這可能是由于酸性條件下會導致蛋白質變性，液滴之間發生聚集，因此粒徑變化較大，而在堿性條件下蛋白質溶解度高，乳液較穩定，粒徑變化小。由圖9D～圖9F可知，在放置24 h 后，在pH2 和pH4 時，3 種植脂末的ζ-電位變化較大，在pH9 時，3 種植脂末的ζ-電位變化較小，且電位的絕對值最大，乳液最穩定。因此酸性條件對乳液的穩定性影響較大，這可能是由于乳液中液滴表面的靜電荷量增大時，液滴之間的靜電斥力增大，從而乳液液滴之間會處于平衡狀態[28]。在強酸性條件下蛋白質與液滴之間相互排斥作用小，易發生聚集，使ζ-電位電勢下降，進而造成乳液不穩定[29]。

2.3.3 植脂末溫度穩定性分析

在不同溫度條件下，植脂末乳液的粒徑、ζ-電位隨時間的變化見圖10。

圖10 3 種植脂末粒徑和ζ-電位隨溫度的變化Fig.10 Variation of particle size and ζ-potential of the three non-dairy creamers with temperature

由圖10 可知，在4 ℃時，由奶渣酪蛋白酸鈣制備的植脂末乳液粒徑和電位變化較小，在24 h 時沒有出現大幅度的波動，且粒徑最小，電位的絕對值最大，說明其在低溫狀態下乳液液滴之間的靜電斥力較高[30]，因此穩定性最好。在45 ℃條件下，3 種植脂末的粒徑和ζ-電位的變化最明顯，這是由于熱處理使蛋白結構展開，暴露出更多帶電基團，液滴之間的斥力勢能較小，蛋白聚集程度增加，穩定性變差[31]。

3 結論

本試驗通過單因素試驗確定了奶渣酪蛋白酸鈣制備的最優條件為溶液pH 值為7、料液濃度為1.00%、Ca（OH）2添加量為1.6%時，奶渣酪蛋白酸鈣中蛋白質含量為93.76%，鈣含量為1.35%。奶渣酪蛋白酸鈣具有優異的乳化能力，ESI 高于奶渣酪蛋白酸鈉，可達到70%以上，起泡能力也高于奶渣酪蛋白酸鈉。由奶渣酪蛋白酸鈣為原料制備的植脂末穩定性好，也進一步證明了奶渣酪蛋白酸鈣優異的ESI，為奶渣酪蛋白酸鈣在植脂末產品的應用上提供了一定的參考。