副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對調節小鼠腸道菌群功能的影響

楊柳，項芳琴，王海霞，姜海莘，李柏良

（東北農業大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

在人體微生物組成中，腸道菌群是一個微小但起著關鍵作用的部分，它參與調節宿主體內的平衡，對宿主體內的生理功能產生影響[1]。近年來，越來越多的研究者將目光聚集到腸道菌群，對不同健康狀態的菌群進行分析，研究結果表明，腸道菌群在腸道健康和各種疾病中發揮著重要的作用[2]，其中副干酪乳酪桿菌是重要的一環。

副干酪乳酪桿菌是乳桿菌屬中的重要成員，它是一種革蘭氏陽性菌。經研究發現副干酪乳酪桿菌在人體腸道中大量存在且對腸道菌群具有調節作用，在發酵乳制品和發酵蔬菜肉中也有大量存在[3]。副干酪乳酪桿菌具有多種功能，可以有效抑制致病菌和腐敗菌的繁殖，通過調節細胞因子的分泌，降低免疫激活作用，從而降低腸易激綜合征的炎癥反應[4]。此外，副干酪乳酪桿菌還能促進消化和吸收，它可以分解食物中的復雜碳水化合物和蛋白質，釋放出營養物質，提高食物的可利用性。同時，副干酪乳酪桿菌還具有保護腸道黏膜、維持腸道菌群平衡的作用，有助于改善腸道健康。除了在食品領域的應用，副干酪乳酪桿菌還被廣泛應用于保健品、藥品和化妝品等領域[5]。

副干酪乳酪桿菌在腸道系統中能夠固定生存繁殖并且在此過程中對腸道有良性影響，從而對機體進行正向調節[6]。Marzotto 等[7]將副干酪乳酪桿菌混合在酸乳中喂食給1～2 歲嬰兒，發現92%實驗對象糞便中含有副干酪乳酪桿菌并且含量最高，這說明副干酪乳酪桿菌能夠在人體內定植。Verdenelli 等[8]對成年人進行分組實驗，研究結果顯示，成年人在攝入副干酪乳酪桿菌后，腸道蠕動明顯增強，表明副干酪乳酪桿菌在調節人體排便方面起到積極的作用。

本研究以副干酪乳酪桿菌Glory LP16 為研究對象，參考保健食品功能評價檢驗方法進行實驗。通過研究副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠體質量和腸道菌群豐度的影響，組織病理學分析、腸道屏障的測定、腸道通透性的測定和短鏈脂肪酸的測定，進而研究副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對腸道健康調節效果，以期為進一步開展和副干酪乳酪桿菌在食品方面應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

副干酪乳酪桿菌Glory LP16 凍干粉（實驗室檢測菌株規格為1.4×1011CFU/g）：金華銀河生物科技有限公司；普通滅菌飼料、墊料：北京維通利華實驗動物技術有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）檢測試劑盒、D-乳酸檢測試劑盒：泉州科諾迪生物科技有限公司；5～6 周齡雄性BALB/c 小鼠[（無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）級]：斯貝福（北京）生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺（DL-CJ-2NDI）：蘇州安泰空氣技術有限公司；電熱恒溫培養箱（BG-160）：上海一恒科技有限公司；立式蒸汽滅菌器（LS-28HD）：上海申安醫療器械廠；臺式高速離心機（TGL-16G）：上海安亭科技儀器廠；超低溫冰箱（DW150）：青島海爾集團；酶標儀（Multiskan GO）、熒光定量聚合酶鏈式反應儀（abi 7500）：美國賽默飛公司；糞便處理儀（PhenoMaster）：德國TSE Systems 公司；光學顯微鏡（CX21）：日本奧林巴斯公司；氣相色譜（7890B）：美國Agilent 公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物

48 只BALB/c 小鼠，飼養環境為溫度22 ℃、濕度50%，12 h 光照，標準飼料喂養，自由飲水。適應性飼養1 周，隨機將實驗動物分成4 組，每組12 只。實驗過程中所有動物操作均按照東北農業大學《實驗動物管理條例》進行，經東北農業大學動物倫理委員會批準。

1.3.2 劑量分組及受試樣品給予時間

小鼠被隨機分為4 組：對照組、副干酪乳酪桿菌Glory LP16 低劑量組、副干酪乳酪桿菌Glory LP16 中劑量組、副干酪乳酪桿菌Glory LP16 高劑量組。其中對照組小鼠灌胃等體積的生理鹽水，各組樣品進行14 d實驗。具體分組見表1。

表1 實驗分組Table 1 Experimental grouping

1.3.3 樣品準備

在每日灌胃前，分別取一定量的副干酪乳酪桿菌Glory LP16 菌粉按照濃度溶解在生理鹽水中。

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 體質量變化

記錄小鼠實驗結束時空腹體質量。

1.3.4.2 腸道菌群變化

在每天給小鼠進行灌胃前，在無菌環境中，從小鼠的肛門內獲取0.1 g 的糞便樣品，并進行10 倍系列稀釋，分別接種在雙歧桿菌瓊脂、乳酸桿菌選擇性瓊脂、伊紅美藍瓊脂、疊氮鈉-結晶紫七葉苷瓊脂和胰胨-亞硫酸鹽-環絲氨酸瓊脂平板，檢測糞便中雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌、產期莢膜梭菌數量。培養結束后，通過觀察菌落形態、進行革蘭氏染色和生化反應等鑒定方法，計算出每克濕便中的菌落數量，公式如下。

C= lg(T×N/M)

式中：C為菌落數量，lg（CFU/g）；T為平均菌落計數，CFU/g；N為稀釋倍數；M為取樣質量，g。

在最后一次灌胃后的24 h 內，使用相同的方法進行樣品采集和檢測。觀察并記錄雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、腸桿菌和產氣莢膜梭菌的變化情況。

1.3.4.3 組織病理學分析

經過蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色后通過顯微鏡觀察腸道病理結構。

1.3.4.4 腸道屏障的測定

利用實時定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測腸道黏蛋白1（mucin1，MUC1）、黏蛋白2（mucin2，MUC2）和緊密連接蛋白[閉鎖小帶蛋白1（zonulaoccludens1，ZO-1）、Occludin和Claudin-1]相關基因的mRNA 表達水平而測定腸道屏障。

1.3.4.5 腸道通透性的測定

利用試劑盒測定腸道中LPS 和D-乳酸的含量。

1.3.4.6 短鏈脂肪酸的測定

在糞便樣本盒中放入盲腸內容物1 g。用糞便處理儀處理樣品并配制懸濁液（質量分數10%）。將1 mL懸濁液和200 μL 巴豆酸與偏磷酸混合溶液混合均勻并在-20 ℃下冷凍1 d。解凍后，離心3 min（8 000 r/min，4 ℃），蛋白質被清除分離。最后用0.22 μm 過濾器過濾上清液后得到待測樣品，樣品用氣相色譜進行測定。

1.4 數據處理與分析

數據采用平均值±標準差表示，利用SPSS 26.0 軟件進行Duncan′s test 差異顯著性分析。當P<0.05 時，表示差異顯著；P<0.01 為差異極顯著，P>0.05 為差異不顯著。使用Graph Pad 軟件進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠體質量的影響

副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠體質量的影響如圖1 所示。

圖1 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠體質量的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus paracasei Glory LP16 on body weight of mice

由圖1 可知，干預前，各組小鼠體質量無明顯差異。與干預前相比，干預14 d 后各組小鼠體質量顯著增加（P<0.05），但各組之間無明顯差異，這意味著副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠的消化吸收、代謝或者其他生理過程產生了積極的影響，對小鼠的生長無不良影響[9]。

2.2 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對腸道菌群的影響

副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道菌群的影響如圖2 所示。

圖2 小鼠腸道菌群的變化Fig.2 Changes in intestinal flora of mice

由圖2 可知，小鼠在干預前，小鼠糞便中各類菌含量無顯著差異（P>0.05），這表明不同組的小鼠腸道菌群較為一致。干預前后相比，對照組小鼠糞便中的腸道菌群無顯著差異（P>0.05）；各組小鼠灌胃給予副干酪乳酪桿菌Glory LP16 14 d 后，小鼠糞便內乳桿菌、雙歧桿菌均顯著增加（P<0.05）；腸桿菌和腸球菌未見顯著變化（P>0.05）；產氣莢膜梭菌顯著減少（P<0.05）。干預后與對照組相比，灌胃給予副干酪乳酪桿菌Glory LP16 14 d 后，低、中、高劑量組小鼠糞便雙歧桿菌極顯著升高（P<0.01）；中、高劑量組小鼠糞便乳桿菌極顯著升高（P<0.01），產氣莢膜梭菌極顯著降低（P<0.01）；低劑量組小鼠糞便乳桿菌顯著升高（P<0.05），產氣莢膜梭菌顯著降低（P<0.05）；其他組別小鼠糞便菌群無顯著性差異（P>0.05）。這可能與小鼠的周齡有關，隨著周齡的增長，小鼠的腸道容量也增加，從而導致腸道菌群種類和數量以及腸道環境發生變化，但總體趨勢是益生菌的含量增加，致病菌含量減少[10-11]。根據保健食品檢驗與評價技術規范中的判定標準，如果雙歧桿菌或乳桿菌明顯增加，而腸球菌、腸桿菌、產氣莢膜梭菌減少或無明顯變化或增加幅度低于雙歧桿菌、乳桿菌的增加幅度，則可以判定樣品在調節腸菌群功能方面具有陽性效果。根據干預后腸道菌群變化符合陽性結果判定標準的推論，可以得出,副干酪乳酪桿菌LP16 具有調節腸道菌群的作用。

2.3 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道組織病理分析

HE 染色的結果反映了各實驗組小鼠小腸的組織病理變化情況，并可以以此來評價副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對腸黏膜組織結構的影響。副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道組織病理分析如圖3所示。

圖3 小鼠結腸組織病理學（HE 染色）Fig.3 Mouse colon histopathology（HE staining）

由圖3 可知，與對照組相比，低、中、高劑量組的小鼠結腸黏膜腺體排列整齊，上皮組織完整清晰，隱窩、杯狀細胞無損傷，無炎癥細胞浸潤，無潰瘍面。因此，可以推斷副干酪乳酪桿菌Glory LP16 沒有破壞腸黏膜組織結構，維持了腸道組織完整性，這與Pachlová 等[12]研究結果一致。

2.4 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道屏障的影響

根據已有研究，黏蛋白1（MUC1）、黏蛋白2（MUC2）和緊密連接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）的mRNA 表達量可以間接反映腸道屏障的功能。各組小鼠黏蛋白和緊密連接蛋白的相關mRNA 表達量表達水平比較如表2 所示。

表2 各組小鼠黏蛋白和緊密連接蛋白的相關mRNA 表達量表達水平比較Table 2 Expression of mRNAs related to mucin and tight junction proteins in mice of each group

由表2 可知，與對照組相比，副干酪乳酪桿菌組小鼠腸道MUC1、MUC2、Occludin、ZO-1與Claudin-1蛋白的mRNA 表達量都增加，差異呈顯著性（P<0.05）。隨著副干酪乳酪桿菌劑量的增加，黏蛋白和緊密連接蛋白的mRNA 表達量也隨之增加。這表明副干酪乳酪桿菌還能夠調節緊密連接蛋白的表達，增強腸道上皮細胞之間的連接性，加強腸道屏障的完整性，副干酪乳酪桿菌通過多種機制，促進腸道屏障的功能，有助于維護腸道健康和預防腸道疾病[13]。

2.5 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道通透性的影響

在分子水平上，LPS 和D-乳酸是評估腸道屏障損傷的重要指標。LPS 通常存在于革蘭氏陰性菌的外膜中，可以增加胃腸黏膜上皮的通透性，使內毒素能夠通過細胞旁透作用進入腸內，從而引起細胞因子的失控性表達，加劇腸道炎癥[14]。體內脂多糖炎癥模型是目前較為常見的腸黏膜損傷免疫應激模型[15]。本研究使用LPS 檢測試劑盒和D-乳酸檢測試劑盒分別檢測小鼠血清中LPS 和D-乳酸的含量，從而探究副干酪乳酪桿菌對小鼠腸道屏障通透性的影響，結果如圖4 所示。

圖4 腸道通透性測定Fig.4 Measurement of intestinal permeability

由圖4 可知，與對照組相比，副干酪乳酪桿菌組中LPS 和D-乳酸的含量顯著降低（P<0.05）。這表明副干酪乳酪桿菌可以有效提升腸道屏障，減少LPS 和D-乳酸的泄漏。結果表明副干酪乳酪桿菌對維護腸道屏障功能有積極影響。

2.6 副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道短鏈脂肪酸含量的影響

腸道短鏈脂肪酸（short chain fatty acids，SCFAs）也稱作揮發性脂肪酸，作為一種重要的微生物代謝產物，由難消化多糖的糖酵解產生[16]，在宿主局部環境和系統環境中的多個靶標中發揮著關鍵作用，特別是在腸道屏障和免疫中[17]。SCFAs 的種類和數量決定于腸道菌群和機體生理狀態等因素[18]。腸道內SCFAs 的含量不僅可以反映腸道細菌的活力，還強烈影響著腸道細胞代謝[19]。其中乙酸、丙酸和丁酸是常見的代謝產物。副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠腸道短鏈脂肪酸含量如圖5 所示。

圖5 小鼠腸道短鏈脂肪酸含量Fig.5 Content of short-chain fatty acid

由圖5 可知，與對照組相比，干預14 d 后短鏈脂肪酸含量顯著提高（P<0.05）。乙酸含量明顯高于丁酸及丙酸的含量，這可能是由于副干酪乳酪桿菌通過糖類的代謝途徑產生乙酸。在糖類的代謝過程中，副干酪乳酪桿菌Glory LP16 將糖類分解為較小的分子，然后進一步代謝產生乙酸。這個過程需要多個酶的參與，包括糖類分解酶、乙酰輔酶A 合成酶等[20]。副干酪乳酪桿菌Glory LP16 可能具有較高的糖類代謝酶活性，導致乙酸的生成量較高[21]。丁酸和丙酸含量相對較低可能是因為副干酪乳酪桿菌Glory LP16 在其他代謝途徑上的酶活性不夠優化。除了糖類代謝途徑，副干酪乳酪桿菌還可以通過其他代謝途徑產生SCFAs，如蛋白質和脂肪的代謝[22]。然而，副干酪乳酪桿菌Glory LP16 可能在這些代謝途徑上的酶活性相對較低，導致丁酸和丙酸的生成量較低。這表明副干酪乳酪桿菌Glory LP16 有助于小鼠腸道中乙酸、丙酸和丁酸的合成。

3 討論

腸道健康是當下世界持續關注的重點健康問題，維持腸道菌群在數量上和分布上的平衡狀態對維護機體健康具有重要意義[23]。本研究發現副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠生長具有積極作用，對能量的攝取和利用起著重要調節作用。攝入副干酪乳酪桿菌Glory LP16 的小鼠小腸黏膜組織結構完好，腺體排列整齊，這與田豐偉等[24]關于副干酪乳酪桿菌LC01 調節人體腸道菌群的結果一致。攝入副干酪乳酪桿菌Glory LP16 的小鼠促進了腸道中雙歧桿菌和乳桿菌的增殖，根據保健食品檢驗與評價技術規范中調節腸道菌群和通便功能評價方法，可推測攝入副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對于改善腸道微生態，促進腸道健康具有積極的作用。

腸道屏障功能對于腸道炎癥的發展至關重要[25]。黏蛋白（MUC1、MUC2）和緊密連接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）是構成腸黏膜屏障的重要成分，影響著腸道黏膜的通透性和完整性。黏蛋白在腸道上皮細胞表面形成黏膜屏障，當其異常表達導致屏障結構破壞時，會引發腸道炎癥的發生[26]。本研究發現，高劑量組副干酪乳酪桿菌Glory LP16 的攝入可以顯著提高黏蛋白（MUC1、MUC2）和緊密連接蛋白（Claudin-1、Occludin、ZO-1）的mRNA 表達水平。此外，高劑量組小鼠血清中LPS 和D-乳酸的含量顯著降低，短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸、丁酸）含量增加。這均表明副干酪乳酪桿菌Glory LP16 可以通過提高腸道屏障功能來發揮作用，從而維護腸道的完整性和健康。這一研究結果與其他類似的研究結果相似，進一步驗證了副干酪乳酪桿菌Glory LP16 在腸道屏障保護方面的作用[27-28]。

4 結論

副干酪乳酪桿菌Glory LP16 對小鼠生長和調節腸道菌群方面具有積極的作用，同時還能夠維護小鼠腸道組織的完整性、增強腸道屏障、改善腸道通透性，并且提高短鏈脂肪酸的含量。本研究結果為副干酪乳桿菌Glory LP16 益生菌制劑的合理應用以及保健食品的開發提供了理論依據。