西藏芫根中總多糖含量測(cè)定方法及單糖指紋圖譜研究*

呂倩倩，謝和兵，4△，尼瑪次仁，白瑪?shù)┰?/p>

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230013； 2.江蘇省南通市海門長(zhǎng)三角藥物高等研究院，江蘇南通 226133；3.江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司，江蘇南通 226133； 4.西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，西藏日喀則 857000）

芫根Brassica rapaL.又名蕪菁、蔓菁，藏語(yǔ)名為妞瑪，味甘，性溫，有清熱解毒、滋補(bǔ)增氧之功效，是青藏高原地區(qū)特有的食、藥、飼三用植物［1］。芫根生長(zhǎng)周期快，適應(yīng)性和抗逆性較強(qiáng)，含有多糖［2］、黃酮［3］、皂苷［4］、硫代葡萄糖苷［5］等多種生物活性成分，有效增強(qiáng)免疫力［6］，起到抗輻射、抗疲勞、抗菌抗炎［7］、降血糖［8］、抗缺氧［9-10］等作用，在醫(yī)療、食品等行業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。芫根藥材現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為《西藏自治區(qū)藏藥材標(biāo)準(zhǔn)：第2 冊(cè)》［11］，但僅包括性狀、薄層鑒別、炮制、性味，無(wú)成分的定量指標(biāo)，藥材質(zhì)量控制水平較低，亟須提高。本研究中采用紫外分光光度法測(cè)定芫根中總多糖的含量，并建立單糖柱前衍生高效液相色譜指紋圖譜，旨在為西藏芫根藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

20B 型高效萬(wàn)能粉碎機(jī)（常州市強(qiáng)迪干燥設(shè)備有限公司）；LC-16A型高效液相色譜儀，UV-1900i型紫外可見分光光度計(jì)，均購(gòu)自日本Shimadzu公司；JA10003N型電子天平（精度為千分之一），DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，UC-250DE型超聲清洗儀（功率為250 W，頻率為50 kHz），均購(gòu)自上海精其儀器有限公司；XSR205DU/ AC 型分析天平（美國(guó)Mettler Toledo 公司，精度為十萬(wàn)分之一）；HH - 6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；PHS-3C 型雷磁酸度計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；XH - C 型渦旋振蕩器（常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

D- 無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)為110833 - 202109，純度為99.9%），半乳糖對(duì)照品（批號(hào)為100226 -201807，純度為100.0%），D- 甘露糖對(duì)照品（批號(hào)為140651 - 201805，純度為100.0%），D- 葡萄糖醛酸對(duì)照品（批號(hào)為140648 - 202005，純度為99.1%），D- 半乳糖醛酸對(duì)照品（批號(hào)為111646 - 201702，純度為95.1%），鼠李糖對(duì)照品（批號(hào)為111683 - 201502），阿拉伯糖對(duì)照品（批號(hào)為111506 - 200202），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；苯酚（批號(hào)為20220110），甲醇（分析純，批號(hào)為20220824），氫氧化鈉（分析純，批號(hào)為20210220），硫酸（批號(hào)為20211202），磷酸二氫鉀（分析純，批號(hào)為20220514），1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，化學(xué)純，批號(hào)為20220316），三氟乙酸（分析純，批號(hào)為20220105），三氯甲烷（批號(hào)為20211208），均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（上海泰坦科技股份有限公司，批號(hào)為P2141688）。芫根藥材由西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，經(jīng)該公司尼瑪次仁副主任藏藥師鑒定為正品，樣品信息見表1。

表1 蕪根藥材樣品信息Tab.1 Information of Brassica rapa samples

2 方法與結(jié)果

2.1 總多糖含量測(cè)定

2.1.1 溶液制備

取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品10.30 mg，精密稱定，置20 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，搖勻，即得對(duì)照品貯備液；精密吸取對(duì)照品貯備液100 μL，置具塞試管中，加蒸餾水900 μL，搖勻，加5%苯酚溶液1 mL，搖勻，加5 mL 濃硫酸，混勻，稱定質(zhì)量，置沸水浴中加熱15 min，室溫冷卻，加蒸餾水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，即得對(duì)照品溶液。

取芫根粉末（過(guò)4 號(hào)篩）2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加蒸餾水60 mL，稱定質(zhì)量，90 ℃水浴加熱回流1 h，放冷，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)。精密吸取濾液1.5 mL，置25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，即得供試品貯備液［12］；精密吸取供試品貯備液100 μL，置具塞試管中，加蒸餾水900 μL，搖勻，加5%苯酚溶液1 mL，搖勻，再加5 mL 濃硫酸，混勻，稱定質(zhì)量，置沸水浴中加熱15 min，室溫冷卻，加蒸餾水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，即得供試品溶液。

2.1.2 方法學(xué)考察［13-14］

線性關(guān)系考察：精密吸取25，50，100，150，200，250 μLD-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品貯備液，分別置具塞試管中，分別加入蒸餾水975，950，900，850，800，750 μL，按2.1.1項(xiàng)下方法制備系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于484 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)、D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.0 685X+0.001 5（r=0.999 5，n= 6），表明D- 無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度在1.84～18.37 mg/L 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.1.1 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，于484 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度6 次。結(jié)果吸光度的RSD為0.18%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為202211171）芫根粉末（過(guò)4 號(hào)篩），精密稱定，按2.1.1 項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6 份，于484 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并計(jì)算樣品含量（以干品計(jì)）。結(jié)果樣品含量的RSD為0.35%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.1.1 項(xiàng)下供試品溶液，分別于0，1，3，6，12，18，24 h 時(shí)在484 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果供試品溶液吸光度的RSD為1.52%（n= 7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為202211171）芫根粉末（過(guò)4 號(hào)篩）適量，精密稱定，按2.1.1 項(xiàng)下方法平行制備供試品貯備液6份，分別精密吸取供試品貯備液50 μL和2.1.1項(xiàng)下D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品貯備液50 μL，置同一具塞試管中，按2.1.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于484 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每份連續(xù)測(cè)定2 次，計(jì)算平均加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 總多糖加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test of total polysaccharide（n = 6）

2.1.3 總多糖含量測(cè)定

取6批（批號(hào)分別為20220315，202211171，202211172，202211173，20220708，20220725）芫根粉末（過(guò)4 號(hào)篩），按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批樣品平行3 份，于484 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，每份連續(xù)測(cè)定2 次。結(jié)果總多糖的含量（以干品計(jì)）分別為323.12，272.53，274.91，286.44，234.68，321.18 mg/ g（n= 6），平均含量為285.48 mg/g。

2.2 指紋圖譜建立與分析

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate XB - C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-pH 為6.8 的0.1%磷酸鹽溶液（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí)18%A～16%A，10～30 min時(shí)16%A～19%A，30～40 min 時(shí)19%A～21%A，40～45 min 時(shí)21%A，45～50 min 時(shí)21%A～18%A，50～55 min時(shí)18%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取半乳糖、D- 甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D- 無(wú)水葡萄糖、D- 葡萄糖醛酸、D- 半乳糖醛酸對(duì)照品各1.0 mg，精密稱定，分別置50 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解，并定容，即得各單糖的對(duì)照品貯備液；分別取上述單糖對(duì)照品各1.0 mg，精密稱定，置同一50 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，即得混合對(duì)照品貯備溶液。精密吸取各單糖對(duì)照品貯備液、混合對(duì)照品貯備液各400 μL，分別置5 mL 離心管中，依次加入0.3 mol/L 氫氧化鈉（NaOH）溶液400 μL、0.5 mol /L PMP 甲醇溶液400 μL，混勻，置70 ℃烘箱中反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，加入0.3 mol/ L 氯化氫（HCl）溶液400 μL，混勻后加入1 mL 三氯甲烷，渦旋混合1 min，靜置1 min，吸取上層液，0.45 μm 有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)，即得各單糖對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液。

取芫根粉末（過(guò)4 號(hào)篩）0.2 g，精密稱定，置頂空瓶中，加2 mol /L 三氟乙酸溶液6 mL，密封，靜置30 min，置120 ℃烘箱中，加熱4 h，取出，冷卻至室溫，濾過(guò)，殘?jiān)盟礈? 次，每次約6 mL，合并濾液，用1 mol/ L NaOH 溶液調(diào)pH 至7.0，加蒸餾水定容至50 mL 容量瓶中，即得供試品貯備液。精密吸取供試品貯備液400 μL，置5 mL 離心管中，依次加入0.3 mol/ L NaOH 溶液、0.5 mol/L PMP 甲醇溶液各400 μL，混勻，置70 ℃烘箱中反應(yīng)30 min，取出，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L HCl溶液400 μL，混勻后加入1 mL 三氯甲烷，渦旋混合1 min，靜置1 min，吸取上層液，0.45 μm 有機(jī)系微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液［15-16］。

2.2.3 指紋圖譜建立與共有峰指認(rèn)

取6 批芫根粉末（過(guò)4 號(hào)篩），分別按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，另取2.2.2 項(xiàng)下各單糖對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行積分處理后，以AIA 格式導(dǎo)出，將指紋圖譜依次導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.0版）中［17］，以S1 為參照，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.1，經(jīng)多點(diǎn)校正和全譜峰匹配后［18-19］，生成6 批芫根藥材樣品色譜圖的疊加指紋圖譜（圖1），共識(shí)別出19個(gè)共有峰，通過(guò)與混合對(duì)照品溶液色譜峰（圖2）比對(duì)，指認(rèn)出峰4為D-甘露糖、峰7為鼠李糖、峰10為D-葡萄糖醛酸、峰12為D-半乳糖醛酸、峰13為D-無(wú)水葡萄糖、峰14為半乳糖、峰16為阿拉伯糖。色譜圖見圖3。

圖1 6批芫根藥材高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC overlay fingerprints of six batches of Brassica rapa

4.D - 甘露糖 7.鼠李糖 10.D - 葡萄糖醛酸 12.D - 半乳糖醛酸 13.D - 無(wú)水葡萄糖 14.半乳糖 16.阿拉伯糖圖3 蕪根藥材高效液相色譜對(duì)照指紋圖譜4.D - mannose 7.Rhamnose 10.D - glucuronic acid 12.D - glucuronic acid 13.D - anhydrous glucose 14.Galactose 16.ArabinoseFig.3 HPLC reference fingerprint of Brassica rapa

2.2.4 相似度評(píng)價(jià)

以6 批芫根藥材樣品生成的共有模式為對(duì)照指紋圖譜，計(jì)算各批間的相似度［20］，結(jié)果相似度為0.946～1.000，表明不同批次的芫根藥材多糖化學(xué)成分具有一致性，組成多糖的單糖成分相同。詳見表3。

表3 6批芫根藥材指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.3 Evaluation results of similarity in fingerprints of six batches of Brassica rapa samples

3 討論

芫根生長(zhǎng)于3 500 m 以上的高海拔地區(qū)，主產(chǎn)于西藏的曲水、昌都等地，本研究中收集的藥材樣品來(lái)自西藏拉孜縣、聶拉木縣、曲水縣、山南市、昌都市5個(gè)地區(qū)，這些地區(qū)平均海拔均超過(guò)3 500 m，能代表高原芫根的高海拔產(chǎn)地的特征。

芫根中含有總多糖、黃酮、多酚等成分，多糖為芫根中的主要活性成分，具有抗缺氧、抗輻射、提高免疫力等作用［21-23］。多糖是由多個(gè)單糖縮合而成的生物大分子物質(zhì)，常以糖苷鍵線性或分枝鏈接而成，如枸杞、黃芪、靈芝等中藥的有效活性成分均為多糖。測(cè)定多糖含量的方法主要有紫外分光比色法、高效液相色譜法、酶法等，目前常用苯酚- 硫酸紫外分光比色法［24-25］，其原理是多糖在濃硫酸作用下水解成單糖，迅速脫水生成糠醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，該方法操作簡(jiǎn)單快速，重復(fù)性好，顯色后供試品溶液穩(wěn)定性好。前期試驗(yàn)中，采用蒽酮-硫酸法測(cè)定總多糖含量，但供試品溶液穩(wěn)定性較差，可能與樣品中的蛋白質(zhì)對(duì)顯色反應(yīng)有干擾相關(guān)［26］。故本研究中采用苯酚-硫酸紫外分光比色法測(cè)定總多糖含量，將對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，掃描范圍為200～800 nm，結(jié)果對(duì)照品溶液于484 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)確定為484 nm。同時(shí)，本研究中通過(guò)單糖的高效液相色譜指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，D- 無(wú)水葡萄糖的含量約為60%，故選擇D-無(wú)水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。

中藥指紋圖譜是選取其中某些重要的特征信息作為控制中藥質(zhì)量的重要鑒別手段，具有整體性、特征性及可量化的特點(diǎn)，是一種有效的質(zhì)量控制方式。PMP 在堿性條件下可與單糖定量縮合成PMP - 單糖衍生物，該物質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，于250 nm 波長(zhǎng)處有強(qiáng)光吸收，故以PMP 為衍生試劑。通過(guò)高效液相色譜法比較不同產(chǎn)地西藏芫根藥材中單糖的指紋圖譜，共識(shí)別出19 個(gè)共有峰，并指認(rèn)出7 個(gè)特征峰，初步分析出芫根多糖由D-無(wú)水葡萄糖、D-甘露糖、鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D- 葡萄糖醛酸、半乳糖和阿拉伯糖7 種單糖構(gòu)成，進(jìn)一步明確了西藏芫根多糖中單糖的分布規(guī)律，為其多糖結(jié)構(gòu)分析和質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果穩(wěn)定可靠，可用于西藏蕪根中總多糖的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)。