X 射線熒光光譜法快速定量桂利嗪片中7 種元素雜質*

劉荷英，蓋榮銀，張 敏，林凱鵬，劉 寧，程奇珍△

（1.江西省藥品檢驗檢測研究院·國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室·江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西南昌 330029； 2.島津企業管理< 中國> 有限公司，四川成都 610023）

2008 年，歐洲藥物評審委員會（EMEA）發布了《金屬催化劑或金屬試劑殘留限度指南》［1］，規定了14種金屬元素的限度。2012 年，《美國藥典》（USP35）第二增補本新增通則<232>元素雜質限度和<233>元素雜質測定［2］，包括24 種元素限度及電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）法和電感耦合等離子體光譜（ICP-OES）法2 種元素雜質的測定方法。2014 年，人用藥品注冊技術要求國際協調會（ICH）實施Q3D 元素雜質指導原則［3］，基于風險的評估方法對元素雜質進行測定，對藥品全生命周期內存在的元素雜質進行控制。國家藥典委員會于2023 年起草了《元素雜質指導原則》，并先后2 次發布了公示稿，向全社會公開征求意見，旨在盡早與國際接軌。元素雜質的測定方法包括ICP - MS 法、ICP -OES法、原子吸收光譜（AAS）法、X射線熒光光譜（XRF）法等。XRF 法是近年來發展起來的一種元素檢測方法，為無損分析技術，大多數樣品可直接測定，適用于固體、粉末和液體樣品中元素的定性和定量測定。XRF 儀分為波長色散型（WD）和能量色散型（ED）［4］。EDXRF可同時捕獲由樣本產生的多種熒光X射線的能量，且使用較低功率的X 射線源，不會對樣品造成顯著損傷。XRF 收載于USP38通則<735>［5］，也收載于2020年版《中國藥典（四部）》通則0461［6］，可作為藥品元素雜質風險評估的替代分析方法［7］。XRF 法突出優點為檢測元素范圍廣、前處理簡便、無污染，且為無損檢測，適合快速篩查。據報道，XRF法測定藥品中的元素雜質［7-9］，但由于不同藥品的服用劑量差異巨大，根據每日暴露量（PDE）值計算的限度濃度差異大，且不同藥品的基質不同，XRF法可能會存在基質干擾［10］。因此，需考察XRF法對不同藥物的適用性。國內曾報道，采用XRF 技術測定明膠中鉻含量［11］和中藥材中元素含量［12］，但尚無基于ICH Q3D 經XRF 法進行化學藥品元素雜質風險評估的應用報道。桂利嗪片是一種口服的血管擴張藥［13］，其藥品標準及相關文獻中均無元素雜質的測定方法。本研究中基于ICH Q3D，采用EDXRF技術建立了桂利嗪片中鉛（Pb）、鎘（Cd）、砷（As）、汞（Hg）、鈷（Co）、釩（V）、鎳（Ni）共7 種元素的內標標準曲線法，并對多家企業的桂利嗪片進行元素雜質含量測定和風險評估。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

EDX - 7000 型EDXRF 儀（日本Shimadzu 株式會社）；BSA124S-CW型電子天平（賽多利斯科學儀器<北京> 有限公司，精度為0.1 mg）；VD53 型真空干燥箱（德國Binder 公司）；Milli-Q Reference 型超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

Cd 標準溶液（1 000 mg/L，批號為GBW08612），Hg標準溶液（1 000 mg/ L，批號為GBW08617），均購于中國計量科學研究院；Pb 標準溶液（1 000 mg/L，批號為GSB04-1742-2004），As 標準溶液（1 000 mg/L，批號為223004 - 7），Co 標準溶液（10 000 mg/ L，批號為22D40231），V 標準溶液（10 000 mg/ L，批號為22D30736），Ni 標準溶液（10 000 mg/ L，批號為22D40585），均購于國家有色金屬及電子材料分析測試中心；桂利嗪片（規格為每片25 mg；仿制制劑，生產企業A，批號分別為2101001，2011003；生產企業B，批號分別為210302，210303；生產企業C，批號分別為210101，201101；生產企業D，批號分別為384190601，384201101；生產企業E，批號為200501；生產企業F，批號為210301；生產企業G，批號分別為04180302，04200701；生產企業H，批號分別為2012262511，2007272512；生產企業I，批號為20200901；生產企業J，批號為201101）；桂利嗪片（原研制劑，比利時Janssen 公司，批號為IJL3800，規格為每片25 mg）；60%硝酸（美國Merck 公司，批號為K95742118）；去離子水（自制）。

2 方法與結果

2.1 儀器參數

元素范圍：11Na -92U；靶材：銠（Rh）；電壓：50 kV；電流：100 μA；氛圍：空氣；準直器：10 mm；測試時間：3 100 s；分析方法：定量工作曲線法；定量元素：Cd，Pb，As，Hg，Co，V，Ni，方法參數見表1。

表1 定量元素方法參數Tab.1 Method parameters of the quantitative elements

2.2 PDE 值與限度

ICH Q3D 中各元素不同給藥途徑的PDE 值不同，桂利嗪片用法用量為口服，每日3 次，每次25～50 mg，最大日劑量為6片。參考口服給藥途徑的PDE值（μg/d），10 家企業的仿制制劑平均片重在0.07～0.11 g 之間，原研制劑平均片重為0.25 g。綜合考慮各企業樣品測定的適用性，以0.1 g為平均片重，即最大日劑量為0.6 g，各元素限度（μg/ g）= PDE/ 最大日劑量，控制閾值為30%限度。各元素PDE值與限度見表2。

表2 7種待測元素的PDE值與限度Tab.2 PDE values and limits for seven elements

2.3 測定法

分別取標準系列溶液、桂利嗪片和制備的供試品粉末各適量，置帶有聚丙烯膜的樣杯中，使樣品所占體積為樣杯體積的1/2 以上。采用EDXRF 儀測定待測元素與校正元素的熒光強度比，按標準曲線法定量測定待測元素的含量。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：精密量取硝酸1 mL，置100 mL容量瓶中，用去離子水定容，得1%硝酸溶液，即得空白溶劑。通過比對標準系列溶液、空白溶劑、片劑樣品和100%限度濃度的加標回收率樣品中各元素的分析圖譜來驗證專屬性，發現7 種待測元素中僅Ni 元素在空白溶劑和樣品中存在背景干擾，其余元素均不存在干擾。因此，設置Ni元素的背景扣除，通過測量空白溶劑的Ni元素含量，設置Ni 元素重疊校正系數，以排除空白干擾。詳見圖1。

A.空白溶劑 B.供試品溶液圖1 專屬性試驗光譜圖A.Blank solvent B.Test solutionFig.1 Spectrograms of the specificity test

線性關系考察：分別精密量取Cd標準溶液1.660 mL，Pb 標準溶液1.660 mL，As 標準溶液5.000 mL，Hg 標準溶液10.000 mL，Co 標準溶液1.666 mL，V 標準溶液3.335 mL，Ni 標準溶液6.670 mL，置同一100 mL 容量瓶中，用1%硝酸溶液定容，搖勻，即得各元素濃度均為2.0 倍限度的混合貯備液，分別精密量取0，2.5，6.25，12.5，18.75 mL，各置25 mL容量瓶中，用1%硝酸定容，即得含各元素濃度分別為0，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0倍限度的系列標準溶液（水的密度約為1.0 g/ cm3，可折算為1 mg/ kg）。取系列標準溶液，按2.3 項下方法測定，以待測元素含量（X，mg/ kg）為橫坐標、待測元素與校正元素的熒光強度比值（Y）為縱坐標進行線性回歸，用最小二乘法求得線性回歸方程。結果見表3。

表3 線性關系考察結果Tab.3 Results of the linear relation test

檢測限與定量限確定：取空白溶劑，按2.3 項下方法連續測定11 次，根據線性回歸方程，求得11 次的測得濃度，計算SD值，以SD值的10 倍為各待測元素的定量限，SD值的3倍為各待測元素的檢測限。結果見表4。

表4 檢測限與定量限確定結果（mg/kg）Tab.4 Results of LOD and LOQ（mg / kg）

準確度與精密度試驗：取桂利嗪片（A企業，批號為2101001）500 片，稱定質量，研細，取細粉3.0 g，共9 份，置50 mL 塑料離心管中，分別精密加入1%硝酸溶液和濃度為0.5，1.0，1.5倍限度的標準系列溶液各3.0 mL，攪拌均勻且成糊狀，置含五氧化二磷（P2O5）的真空干燥箱中，干燥1 d 至樣品成干燥狀態，研勻，即得空白供試品和各元素濃度約為0.5，1.0，1.5 倍限度的回收率供試品，細粉全部轉移至樣品杯中，按2.3項下方法測定。根據線性回歸方程，計算各元素的測得濃度，將回收率供試品中各元素測得值扣除空白供試品中測得值后與理論濃度進行比較，計算各回收率供試品的回收率，并分別計算各濃度水平的平均回收率、總平均回收率和RSD值。結果見表5。

表5 準確度與精密度試驗結果Tab.5 Results of the accuracy and precision tests

重復性試驗：取準確度與精密度試驗項下桂利嗪片細粉3.0 g，共6份，置50 mL塑料離心管中，分別精密加入濃度為1.0倍限度的混合系列標準溶液3.0 mL，攪拌均勻且成糊狀，置含P2O5的真空干燥箱中，真空干燥1 d 至樣品成干燥狀態，研勻，細粉全部轉移至樣杯中，按2.3 項下方法測定，根據線性回歸方程，求得6 份供試品中各待測元素的濃度。結果Cd，Pb，As，Hg，Co，V，Ni 濃度的RSD分別為1.64%，2.86%，2.65%，2.98%，2.10%，1.79%，2.41%（n=6），表明方法重復性良好。

中間精密度：不同分析人員于不同日期分別進行重復性試驗，考察不同日期、不同分析人員對方法分析精密度的影響，結果12 份重復性供試品測定Cd，Pb，As，Hg，Co，V，Ni 的RSD分別為2.11%，3.38%，2.93%，4.95%，2.33%，1.86%，2.61%（n=6），表明中間精密度良好。

耐用性試驗：分別取重復性試驗項下的6份供試品細粉各2 g 和3 g，按2.3 項下方法測定，根據線性回歸方程，求得待測元素的測得濃度，計算12次測定結果的RSD，考察不同樣品量對檢測結果的影響。結果回收率供試品Cd，Pb，As，Hg，Co，V，Ni 的RSD分別為2.04%，3.08%，2.72%，10.69%，2.49%，1.68%，2.38%（n=12），表明方法耐用性良好。

2.5 樣品元素雜質含量測定

取桂利嗪片適量，直接置帶有聚丙烯膜的樣杯中，按2.3項下方法測定，計算桂利嗪片中各待測元素的含量。11 家企業的17 批桂利嗪片測試結果見表6。可見，各企業生產的桂利嗪片中Cd，Pb，As，Hg，Co，V 6 種元素測得含量均低于定量限，部分企業Ni 元素含量略高于定量限。各企業生產的桂利嗪片及原料藥中7種元素測試結果均低于控制閾值，表明各企業的桂利嗪片現行生產工藝未帶入有害元素風險。

表6 不同企業樣品中7種元素雜質含量測定結果（mg/kg）Tab.6 Results of the content determination of seven elemental impurities in samples from different manufacturers（mg / kg）

3 討論

3.1 元素雜質風險評估

本研究中基于ICH Q3D 對桂利嗪片的元素雜質進行風險評估。1 類元素是對人體有害的元素，在藥品生產中禁用或限制使用；2 類元素通常是給藥途徑依賴型的人體有害元素，根據出現于藥品中的相對可能性，進一步分成2A 類和2B 類，2A 類元素出現在藥品中的可能性高；3 類元素口服給藥途徑的毒性相對較低。對于口服給藥途徑的藥物而言，1 類元素Cd，Pb，As，Hg 和2A類元素Co，V，Ni均需進行風險評估。本研究中直接測定制劑中各元素的實際含量，結果桂利嗪片和原料藥中7種元素雜質含量均低于控制閾值，未發現安全風險。

3.2 方法優化與驗證

每個元素有多個譜線，選擇合適的譜線進行分析可有效避免元素雜質間的相互干擾和基質干擾。所建立的標準曲線法中采用了內標校正，可校正背景干擾及不同形態的測量誤差。此外，采用EDXRF進行片劑測試時需注意片劑包衣對測試結果的影響，對各企業樣品進行片劑直接測定和片劑除包衣后測定結果的對比發現，桂利嗪片除包衣前后測試圖譜一致，在各元素分析線處均未不存在干擾，表明包衣對測定結果無影響，可不除包衣直接進行測定。

標準曲線除零點外設計了5 個濃度點，以1.0 倍限度為中心，將標準溶液的濃度設為0.2～2.0倍限度。方法驗證部分，各項目的要求同時參考了USP<233>和《歐洲藥典》（EP）2.4.20［14］，準確度均通過加標回收率來考察，加標濃度在50%～150%倍限度范圍，每個濃度的3份樣品的平均回收率均需在70%～150%，本研究中7種元素的3個濃度的平均回收率均符合要求。EP2.4.20要求定量限應低于限度濃度，考慮到風險評估時需關注元素含量是否超出控制閾值，本研究中各待測元素的定量限均低于控制閾值（限度濃度的30%）。耐用性試驗結果表明，樣品量對測試結果影響不大，故不需要定量取樣，但測試時樣杯中的樣品要覆蓋樣杯底，使測試結果更準確。

3.3 形態選擇

本研究中涉及3 種不同物質形態，包括溶液、片劑和粉末，不同形態的選擇以簡便為主，以充分體現EDXRF 法快速測定的優勢。標準曲線采用不同濃度的系列標準溶液進行測定，操作簡便，可簡化加標樣品制備過程。測試加標樣品時，要考察樣品基質對測定結果的影響，由于加標樣品需將片劑研成粉末后才能加標，并需混合均勻。因此，采用粉末形態進行測定，桂利嗪片為片劑形態，直接測定最簡便，且無損檢測不會損失樣品。回收率試驗驗證了以標準系列溶液測量粉末樣品時，回收率均符合要求，說明液體形態和粉末形態的樣品測試誤差在允許范圍內；為了對比片劑和粉末形態對測試結果的影響，對不同企業的桂利嗪片研成細粉后測定，并與片劑直接測定的結果進行對比，結果片劑和粉末樣品中各元素的定量結果一致，且測試圖譜無差異，表明所建立的方法適用于不同形態樣品的測定。由于加標樣品為人工用研缽研細，每次研磨的細粉粒度會存在差異，但不同加標樣品測定結果的精密度和準確度均符合要求，一定程度上說明粉末粒度對測定結果無明顯影響。液體、細粉與片劑的密度差異較大，但不同形態測定結果的誤差符合要求，表明待測物的密度對測定結果無明顯影響。

3.4 方法評價

本研究中建立的XRF 法操作簡便，樣品無須預處理，可直接快速定量桂利嗪片中7 種風險元素雜質，靈敏度高，專屬性強，經方法驗證適用于口服固體制劑桂利嗪片的元素雜質風險評估。目前，國內外藥品中微量元素雜質的測定主要采用的方法為ICP-MS 法［15-16］，但測定固體制劑中元素雜質的含量時通常需加強酸消解后方可測定，樣品制備過程復雜，且制備過程需避免污染，儀器成本較高。XRF法的靈敏度不如ICP-MS法，但可直接測定不同形態的樣品，無需煩瑣的樣品前處理，且為無損分析。