富馬酸丙酚替諾福韋片中有關(guān)物質(zhì)測定及雜質(zhì)鑒定*

章海云，金秉德△，王玲蘭，宿 亮，徐彬濱，朱躍芳

（1.株洲千金藥業(yè)股份有限公司，湖南株洲 412000； 2.湖南省株洲市食品藥品檢驗所，湖南株洲 412000）

富馬酸丙酚替諾福韋片（TAF，商品名VemLidy）是一種新型核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑［1］，于2016 年11 月經(jīng)美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，用于成人代償性肝病患者的慢性乙型肝炎的治療，2018 年11 月在我國獲批上市［2-3］。TAF與抗病毒治療一線藥物富馬酸替諾福韋二吡呋酯片（規(guī)格為每片300 mg）的有效成分相同，但TAF 在細胞內(nèi)能更快水解，有更好的血漿穩(wěn)定性和更強的肝臟靶向性，且其臨床使用劑量約為TDF 的1/10，極大地減少了腎功能損傷、骨密度降低等不良反應(yīng)，安全性更高［4］。為確保TAF 的安全性，需建立有關(guān)物質(zhì)控制方法。目前，各國藥典均未收錄該藥物，其有關(guān)物質(zhì)檢測方法的報道較少，僅通過流動相中加入較高比例四氫呋喃以改善雜質(zhì)分離［5］。由于四氫呋喃具有刺激性和麻醉作用，吸入后易引起上呼吸道刺激、惡心、頭暈、頭痛、中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制及肝、腎功能損害；具有化學(xué)不穩(wěn)定性，易氧化成過氧化物；對液相色譜系統(tǒng)中的peek 管及泵密封墊具有溶脹和腐蝕作用，在有關(guān)物質(zhì)檢驗中具有使用局限性。本研究中建立了測定TAF 中有關(guān)物質(zhì)含量的高效液相色譜（HPLC）法，采用磷酸鹽- 甲醇梯度洗脫程序，以加校正因子的主成分對照品法定量［6-8］；采用二維液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（2D - LC - MS/MS）法對濕熱降解雜質(zhì)進行化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定［9-10］，并推測其形成機理；通過比較不同包裝形式樣品在使用期間的穩(wěn)定性［11-12］，為選擇合適的包裝材料提供依據(jù)，確保藥品全生命周期的質(zhì)量安全、可控。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），配有二極管陣列檢測器（PDA）；Agilent 1260 型高效液相色譜儀，Agilent 1260-Agilent 1290 Infinity Ⅱ型二維液相色譜- G6470A 型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，均購于美國Agilent公司；MS105DU型電子分析天平（精度為0.01 mg），ME204/02型電子分析天平（精度為0.1 mg），均購于Mettler - Toledo 國際貿(mào)易有限公司；KQ -500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

富馬酸丙酚替諾福韋對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為430025 - 202101，純度為99.40%）；雜質(zhì)A 對照品（上海啟太生物科技有限公司，批號為17092071，純度為99.07%；Pharmace chemi Lab，批號為18-TEN-79-12，純度為99.59%）；雜質(zhì)B對照品（深圳菲斯生物科技有限公司，批號為19011537，純度為98.09%；Pharmace Chemi Lab，批號為TAF-2018-09，純度為97.21%）；雜質(zhì)C對照品（CATO Research Chemicals Inc.，批號為CCEM500690-1605，純度為99.90%；Quality Control Chemicals Inc.，批號為08-MAY - 18-03，純度為100.00%）；雜質(zhì)D 對照品（上海啟太生物科技有限公司，批號為1154-A31，純度為97.62%；Quality Control Chemicals Inc.，批號為21-OCT-17-53，純度為96.42%）；雜質(zhì)E 對照品（上海啟太生物科技有限公司，批號為18110562，純度為94.14%；Quality Control Chemicals Inc.，批號為23 - JUL - 18 - 01，純度為98.71%）；富馬酸丙酚替諾福韋片（自制，批號為20200501）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 有關(guān)物質(zhì)測定色譜條件

色譜柱：Waters XBridge C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：A 為0.02 mol / L 磷酸鹽緩沖液（用1 mol/L氫氧化鉀調(diào)pH至6.0）-甲醇（95∶5，V/V），B為甲醇，梯度洗脫（0～5 min 時100%A，20～25 min 時60%A，25～50 min 時60%A →25%A，50～60 min 時100%A；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：260 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

2.1.2 雜質(zhì)鑒定色譜與質(zhì)譜條件

一維液相色譜條件：同2.1.1項下。

二維液相色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（50 mm × 3.0 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液- 甲醇（55∶45，V/V）；流速為0.4 mL/min；柱溫為35 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子源（ESI）；正離子模式；質(zhì)荷比（m/z）掃描范圍為100～1 000；霧化氣和干燥氣為氮氣（N2）；N2壓力為45 psi；N2流速為6 L/min；溫度為350 ℃；碎裂電壓為150 V；二級質(zhì)譜碰撞裂解能量為30 eV。

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品細粉0.4 g（約相當(dāng)于丙酚替諾福韋50 mg），精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加流動相A適量，超聲10 min使溶解，加流動相A定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

丙酚替諾福韋對照品溶液：取富馬酸丙酚替諾福韋對照品28 mg（約相當(dāng)于丙酚替諾福韋25 mg），精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，加流動相A定容，搖勻，再精密量取1 mL，置50 mL容量瓶中，加流動相A定容，搖勻，即得。

靈敏度溶液：精密量取丙酚替諾福韋對照品溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，加流動相A定容，搖勻，即得。

混合雜質(zhì)對照品貯備液：分別取雜質(zhì)A-E 對照品各適量，精密稱定，加少量甲醇適量，超聲使溶解，加流動相A 稀釋制備成每1 mL 中雜質(zhì)A - E 分別含300，250，200，75，75 μg的溶液，即得。

系統(tǒng)適用性溶液：取富馬酸丙酚替諾福韋56 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，分別取雜質(zhì)C 及雜質(zhì)D 對照品各10 mg，精密稱定，置20 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲使溶解，用流動相A 定容，搖勻，置同一50 mL 容量瓶中，加流動相A 稀釋成每1 mL 含1 mg 丙酚替諾福韋、5 μg 雜質(zhì)C 和5 μg雜質(zhì)D的溶液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別精密量取空白溶劑、2.2 項下系統(tǒng)適用性溶液各適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果空白溶劑無干擾，系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中出峰順序依次為富馬酸、雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、丙酚替諾福韋，其中雜質(zhì)C與雜質(zhì)D色譜峰間的分離度為3.43（>1.5）。色譜圖見圖1。

1.富馬酸 2.雜質(zhì)A 3.雜質(zhì)B 4.雜質(zhì)C 5.雜質(zhì)D 6.雜質(zhì)E 7 - 8.工藝雜質(zhì) 9.丙酚替諾福韋A.空白溶劑 B.系統(tǒng)適用性溶液圖1 系統(tǒng)適用性溶液高效液相色譜圖1.Fumarate 2.Impurity A 3.Impurity B 4.Impurity C 5.Impurity D 6.Impurity E 7 - 8.Process impurities 9.Tenofovir AlafenamideA.Blank solution B.System suitability solutionFig.1HPLC chromatograms of the system suitability solution

破壞性試驗：取細粉0.4 g，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加流動相A 20 mL，超聲10 min 使溶解，平行6 份。分別不處理；90 ℃水浴4 h，放至室溫；加0.1 mol/L鹽酸溶液2 mL，90 ℃水浴0.5 h，放至室溫，再加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL 中和；加0.1 mol/ L 氫氧化鈉溶液2 mL，90 ℃水浴0.5 h，放至室溫，再加0.1 mol/L 鹽酸溶液2 mL 中和；加30%過氧化氫溶液1 mL，90 ℃水浴0.5 h，放冷至室溫；強光照射試驗箱（照度為5 000 lx，紫外90 μW/cm2）中放置24 h。加流動相A定容至50 mL，搖勻，濾過，分別作為未破壞、濕熱破壞、酸破壞、堿破壞、氧化破壞及光照破壞溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，濕熱破壞、堿破壞條件下，主要產(chǎn)生雜質(zhì)A 和雜質(zhì)D；酸破壞條件下，主要產(chǎn)生雜質(zhì)D；氧化破壞條件下，主要產(chǎn)生雜質(zhì)A；光照破壞條件下，主要產(chǎn)生雜質(zhì)A 和雜質(zhì)B；各破壞條件下降解雜質(zhì)與已知雜質(zhì)及主峰間的分離度均符合要求，各破壞條件下主峰純度均符合要求，表明主峰無雜質(zhì)包裹；各破壞試驗物料守恒值為0.97～1.03，物料守恒，表明無雜質(zhì)漏檢，方法專屬性較好。色譜圖見圖2。

1.富馬酸 2.雜質(zhì)A 3.雜質(zhì)B 4.未知雜質(zhì)1 5.雜質(zhì)D 6.未知雜質(zhì)2 7.丙酚替諾福韋A.未破壞 B.濕熱破壞 C.酸破壞 D.堿破壞 E.氧化破壞 F.光照破壞圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖1.Fumarate 2.Impurity A 3.Impurity B 4.Unknown impurity 1 5.Impurity D 6.Unknown impurity 2 7.Tenofovir AlafenamideA.Not damaged B.Hygrothermal damage C.Acid damage D.Alkali damage E.Oxidative damage F.Light damageFig.2 HPLC chromatograms of the destructive test

線性關(guān)系考察：分別取富馬酸丙酚替諾福韋對照品28 mg、雜質(zhì)A - E 對照品10 mg，精密稱定，分別置100 mL、10 mL 容量瓶中，加少量甲醇，超聲使溶解，用流動相A溶解并定容，搖勻，作為貯備液。分別精密量取各貯備液適量，加流動相A 逐級稀釋為丙酚替諾福韋（質(zhì)量濃度分別0.20，0.51，5.09，10.18，49.55，198.18，990.92 μg/mL）及雜質(zhì)（雜質(zhì)A 質(zhì)量濃度分別0.04，0.80，4.00，8.00，16.00 μg/mL；雜質(zhì)B 質(zhì)量濃度分別0.13，2.55，12.75，25.50，50.99 μg/mL；雜質(zhì)C質(zhì)量濃度分別0.11，2.25，11.25，22.50，45.00 μg/mL；雜質(zhì)D質(zhì)量濃度分別0.04，0.80，4.00，8.00，16.00 μg/ mL；雜質(zhì)E質(zhì)量濃度分別0.04，0.72，3.59，7.17，14.34 μg/mL）的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以待測成分的質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，結(jié)果見表1，表明丙酚替諾福韋及雜質(zhì)A-E在各自線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation test

雜質(zhì)校正因子考察：以回歸方程中丙酚替諾福韋的斜率除以雜質(zhì)的斜率作為雜質(zhì)的相對校正因子（f），雜質(zhì)A - E 的f分別為0.58，0.69，3.06，0.77，0.87。分別采用不同型號（Waters e2695 型及Agilent1260 型）液相色譜儀、不同型號（Waters XBridge C18柱、Waters Xterra C18柱）色譜柱、柱溫（±5 ℃），以及不同來源對照品，進行線性回歸，并計算雜質(zhì)校正因子。結(jié)果雜質(zhì)A - E 的校正因子平均值分別為0.61，0.70，3.16，0.75，0.85，RSD分別為2.87%，2.50%，1.71%，2.50%，2.67%。

檢測限與定量限確定：取線性關(guān)系考察項下標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，分別以信噪比（S/N）為3 和10 時待測成分的含量為檢測限和定量限。結(jié)果丙酚替諾福韋及雜質(zhì)A-E 的檢測限分別為0.2，0.2，1.0，1.0，0.4，0.4 ng，定量限分別為0.4，0.4，2.0，2.0，0.8，0.8 ng。取定量限溶液連續(xù)進樣測定6 次，結(jié)果峰面積的RSD分別為0.81%，1.64%，0.22%，2.55%，0.49%，1.69%（n=6）。

精密度試驗：取丙酚替諾福韋對照品溶液適量，按2.1.1項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜圖。結(jié)果丙酚替諾福韋峰面積的RSD為0.14%（n= 6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：按2.2項下方法平行制備供試品溶液6 份，取適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，按加校正因子的主成分對照品法以峰面積計算含量。結(jié)果雜質(zhì)A-E和總雜質(zhì)含量的RSD分別為1.68%，4.64%，0.57%，0.85%，0.49%，3.16%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下丙酚替諾福韋對照品溶液及供試品溶液各適量，分別于室溫放置0，2，4，8，12，24 h時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果的RSD為0.90%（n= 6），表明丙酚替諾福韋對照品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，供試品溶液室溫放置4 h 內(nèi)基本穩(wěn)定（8 h 時雜質(zhì)D 及總雜質(zhì)略有增長，雜質(zhì)含量最大變化率分別為0.03%和0.13%）。另取2.2 項下供試品溶液適量，分別于2～8 ℃放置0，2，4，8，12 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果各單個雜質(zhì)及總雜質(zhì)含量最大變化率分別為0.04%和0.08%，表明供試品溶液在2～8 ℃控溫條件放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取本品細粉約0.4 g，精密稱定，按2.2 項下方法制備供試品溶液，分別精密量取混合雜質(zhì)對照品貯備液各1，2，3 mL，加流動相A 稀釋并定容，搖勻，濾過，分別作為相對各雜質(zhì)限度濃度50%，100%，150%的加樣回收試驗溶液，每個濃度各平行制備3份。按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按加校正因子的主成分對照品法以峰面積計算各雜質(zhì)含量，將理論值與測得值比較，并計算加樣回收率。結(jié)果雜質(zhì)A-E的平均回收率分別為100.20%，95.23%，102.36%，94.48%，97.26%，RSD分別為0.50%，0.23%，0.89%，1.02%，1.67%（n=9），表明方法準(zhǔn)確度較好。

耐用性試驗：取2.2 項下系統(tǒng)適用性溶液、靈敏度溶液、丙酚替諾福韋對照品溶液及供試品溶液各適量，按2.1.1項下條件分別進樣測定，以系統(tǒng)適用性溶液中雜質(zhì)C 與雜質(zhì)D 的分離度、靈敏度溶液S/N及雜質(zhì)含量為指標(biāo)，考察柱溫（±5 ℃）、流速（±0.2 mL/min）、流動相pH（± 0.2）、不同型號色譜柱對試驗結(jié)果的影響。結(jié)果各項指標(biāo)的測定結(jié)果均無顯著差異，表明方法耐用性良好。詳見表2。

表2 耐用性試驗結(jié)果Tab.2 Results of the durability test

2.4 濕熱降解雜質(zhì)鑒定

由圖2 B 可知，濕熱破壞條件下產(chǎn)生了未知雜質(zhì)1和2。取2.2 項下濕熱破壞溶液，按2.1.2 項下色譜與質(zhì)譜條件進樣分析，依據(jù)在一級質(zhì)譜圖中準(zhǔn)分子離子峰［M + H］+確定成分的分子式，并進一步依據(jù)二級質(zhì)譜中相關(guān)信息，鑒定出雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)，結(jié)果未知雜質(zhì)1 和2在正離子模式下的準(zhǔn)分子離子峰［M + H］+為m/z688.3，801.4，確定其分子式分別為C27H38N5O14P，C33H49N6O15P，這2 種成分分別較雜質(zhì)D、丙酚替諾福韋多了相同的m/z325，在二級質(zhì)譜中分別可見碎片離子m/z364.6（雜質(zhì)D準(zhǔn)分子離子峰）和m/z477.5（丙酚替諾福韋準(zhǔn)分子離子峰），推測未知雜質(zhì)1 和2 的準(zhǔn)分子離子峰分別為［雜質(zhì)D+342-18+H］+和［丙酚替諾福韋+342-18+H］+，而分子量342的化合物為乳糖，故分析未知雜質(zhì)1和2分別為雜質(zhì)D乳糖加合物及丙酚替諾福韋乳糖加合物（見表3）。以未知雜質(zhì)2為例，其裂解途徑見圖3。

表3 濕熱降解雜質(zhì)結(jié)構(gòu)及特征質(zhì)譜數(shù)據(jù)Tab.3 Chemical structures and MS / MS data of the hygrothermal degradation impurities

2.5 多劑量包裝制劑使用期間穩(wěn)定性有關(guān)物質(zhì)測定

為研究包裝對產(chǎn)品質(zhì)量的影響，按擬訂有關(guān)物質(zhì)檢查方法考察了不同包裝（不含干燥劑，每袋含0.5 g藥用固體紙袋裝硅膠干燥劑，每袋含1.0 g 藥用固體紙袋裝硅膠干燥劑）口服固體藥用高密度聚乙烯瓶裝樣品在擬訂儲存條件下使用期間的穩(wěn)定性，在溫度30 ℃、相對濕度65%長期存放環(huán)境下模擬藥品實際服用的操作，分別于0，10，30，40 d 時測定有關(guān)物質(zhì)的變化情況。結(jié)果顯示，不加干燥劑的包裝形式受空氣中水分的影響，導(dǎo)致降解雜質(zhì)A，B，C 的含量增加；每袋含1.0 g 干燥劑的包裝形式最優(yōu)，可確保使用過程中產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定。詳見表4。

表4 不同包裝制劑使用期間的穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab.4 Results of in - use stability test of preparations with different packaging

3 討論

3.1 色譜條件、系統(tǒng)適用性要求及定量方法選擇

富馬酸丙酚替諾福韋的酸離解常數(shù)（pKa）值為3.9，考慮其在酸堿體系下穩(wěn)定性較差，故采用pH 6.0 的磷酸緩沖鹽-甲醇作為流動相體系，梯度洗脫。在此條件下，丙酚替諾福韋與雜質(zhì)A - E 均能良好分離，且不受該品種工藝雜質(zhì)的干擾。其中，雜質(zhì)C 與雜質(zhì)D 為最難分離雜質(zhì)對，為主要降解雜質(zhì)，且2 種雜質(zhì)的f分別為3.16 和0.75，差異較大，若兩者分離不佳，易影響雜質(zhì)含量結(jié)果的準(zhǔn)確性。故將雜質(zhì)C與雜質(zhì)D色譜峰的分離度作為系統(tǒng)適用性評價指標(biāo)，確保雜質(zhì)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過采用不同型號液相色譜儀、不同型號色譜柱、色譜條件微調(diào)（柱溫±5 ℃），以及不同來源對照品對各雜質(zhì)校正因子進行研究，結(jié)果雜質(zhì)A-E 校正因子平均值分別為0.61，0.70，3.16，0.75，0.85，均超出0.9～1.1 范圍。故最終擬訂采用加校正因子的主成分對照品法進行定量研究。與雜質(zhì)外標(biāo)法相比，檢測結(jié)果無明顯差異，但可有效節(jié)省雜質(zhì)對照品。

3.2 破壞條件選擇

各破壞試驗條件通過多次探索試驗獲得，一般降解5%～20%較合適，需避免二次降解［13-14］，同時結(jié)合降解雜質(zhì)個數(shù)綜合確定合適的降解條件。以酸破壞為例，分別采用0.01 mol/ L 鹽酸溶液2 mL 室溫放置10，30 min，結(jié)果降解總雜質(zhì)分別為0.31%和0.43%，降解較少，故增加鹽酸溶液濃度及延長放置時間；采用0.1 mol/L 鹽酸溶液2 mL 室溫放置1.5 h，結(jié)果降解總雜質(zhì)為1.02%，降解強度不符合預(yù)期；為獲得合適的降解條件，采用0.1 mol/ L 鹽酸溶液2 mL 于90 ℃水浴0.5 h，降解總雜質(zhì)為6.91%，符合預(yù)期，故最終擬訂酸破壞試驗條件。同法最終確定堿破壞、氧化破壞、濕熱破壞及光照破壞試驗條件。

3.3 多劑量藥品包裝形式的影響

由濕熱降解雜質(zhì)成分結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果可知，原料藥富馬酸丙酚替諾福韋中磷酸酯鍵極易水解，從而產(chǎn)生雜質(zhì)D。在濕熱條件下，雜質(zhì)D 及丙酚替諾福韋結(jié)構(gòu)中的伯胺基團與輔料中的還原性乳糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而產(chǎn)生乳糖加合物雜質(zhì)，這與文獻［15 - 16］的研究結(jié)果相似，提示在富馬酸丙酚替諾福韋片的制劑工藝及儲存過程中需控制好溫度和相對濕度，從而可減少相應(yīng)雜質(zhì)的產(chǎn)生。采用不加干燥劑的多劑量包裝形式模擬藥品使用期間的穩(wěn)定性時，因受空氣中水分影響，雜質(zhì)A，B，C 降解明顯，不利于安全用藥，提示該產(chǎn)品包裝材料及包裝形式的選擇應(yīng)重點關(guān)注防潮及除濕功能，可采用含硅膠干燥劑的口服固體藥用高密度聚乙烯瓶作為包裝材料。

3.4 方法評價

本研究中建立的方法專屬性強、靈敏度好、準(zhǔn)確度高，可快速鑒別丙酚替諾福韋乳糖加合物類雜質(zhì)，可用于富馬酸丙酚替諾福韋片的質(zhì)量控制。