CYP3A4 基因位點多態性對托法替布治療類風濕關節炎臨床療效及藥品不良反應的影響*

王 欽，金智華，蔡亮亮

（南通大學附屬醫院，江蘇南通 226001）

類風濕關節炎（RA）以慢性進行性關節病變為主要臨床表現，若不能及時、有效治療，會引起關節破壞、強直、畸形與功能障礙，使疾病進入不可逆階段，甚至導致患者殘疾［1-2］。我國患病人數達400 萬例，且致殘率高［3-4］。RA的常用治療藥物主要有三大類，即皮質醇類藥物、非甾體抗炎藥及緩解病情的抗風濕藥［5］。托法替布是新開發的口服蛋白酪氨酸激酶抑制劑，能有效抑制Janus 激酶（JAK）通路，從而阻斷多種炎性因子的信號轉導［6］。臨床試驗表明，托法替布能有效治療RA，尤其適用于甲氨蝶呤療效不佳或無法耐受較大劑量甲氨蝶呤的中重度RA 患者［7-8］。托法替布可與甲氨蝶呤或其他緩解病情的抗風濕藥聯用，達到協同治療的作用。但并不是所有患者都適用于枸櫞酸托法替布，目前尚無明確的評價體系，盲目、非個體化的用藥勢必會帶來經濟與時間上的損失。托法替布的絕對口服生物利用度約為74%，在體內約70%經肝臟代謝，在肝臟內的代謝主要由細胞色素P450 酶3A4（CYP3A4）介導，也有少量經CYP2C19介導［9］。托法替布在體內的代謝物共8種，其藥理活性主要由母體分子引發。CYP3A4 基因多態性可引起該代謝酶的活性改變，從而可能影響托法替布的療效和藥品不良反應（ADR）［10］。已知的CYP3A4 單核苷酸多態性（SNP）位點有20 余種，其中與中國漢族人相關的SNP 位點主要有CYP3A4*4 A13871G（rs55951658）、CYP3A4*18 T20070C（rs28371759）、CYP3A4*1G G20239A（rs2242480）等，以上3 個SNP 位點均有一定的突變率［11］。本研究中基于某院數據探討了3個SNP 位點CYP3A4*4，CYP3A4*18，CYP3A4*1G基因多態性對托法替布治療RA臨床療效和ADR的影響。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準：符合2009 年美國風濕病協會制訂的RA臨床診斷標準［12］；民族為漢族；國籍為中國。本研究方案經醫院醫學倫理委員會批準，患者簽署知情同意書，在尊重個體自主權、如實告知、保護隱私、不造成傷害的原則下開展研究工作。

排除標準：3 個月內接受免疫抑制劑治療；同時使用強效CYP3A4 誘導劑及中強效CYP3A4 抑制劑；合并其他風濕免疫疾病；妊娠期或哺乳期；合并惡性腫瘤、高血壓、糖尿病、高脂血癥、感染性疾病等；肝腎功能或心功能不全。

病例選擇與分組：選取我院風濕免疫科2020 年2 月至2022 年8 月收治的RA 患者309 例作為RA 組，另選取同期的健康人群165 例作為對照組。RA 組中，男126例，女183例；年齡31～69歲，平均（52.40±10.17）歲。對照組中，男68 例，女97 例；年齡30～68 歲，平均（51.8 ± 9.7）歲。兩組研究對象一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試藥

儀器：NP968 - C 型核酸提取儀，全血DNA 基因組提取試劑盒，均購自西安天隆科技有限公司；3730 XL型熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀（美國ABI 公司）；Biospectrometer 型紫外可見分光光度計，D30 型核酸蛋白檢測儀，均購自德國Eppendorf 公司；HSP92Ⅱ型限制性內切酶（美國Fermentas 公司）；PreMix Taq DNA 聚合酶（美國Thermo Fisher公司）。

試藥：無核酸酶水（美國Thermo Fisher 公司）；枸櫞酸托法替布片（正大天晴藥業集團南京順欣制藥有限公司，批號分別為191008112，200623126，210224124，210927126，220114113，規格為每片5 mg）。

1.3 方法

1.3.1 治療方法

RA 組患者予枸櫞酸托法替布片聯合相同劑量的甲氨蝶呤、來氟米特、碳酸鈣、維生素D3、葉酸治療。其中，枸櫞酸托法替布片每日2次，每次5 mg；甲氨蝶呤每周1 次，每次7.5 mg；來氟米特每日1 次，每次10 mg；碳酸鈣日1次，每次1.5 g；維生素D3每日1次，每次125 IU；葉酸每周1次，每次5 mg，服用甲氨蝶呤的次日頓服。共治療6個月。

1.3.2 試驗方法

標本采集：采集RA組和對照組患者的靜脈血各2 mL，無需空腹，加入EDTA - K2抗凝真空采血管內，置4 ℃冰箱保存，待測。

DNA提取：采用磁珠法自動提取全血DNA基因組，嚴格按試劑盒說明書操作。自動提取后，采用電泳法檢測DNA 是否提取完整，采用紫外可見分光光度計檢測DNA 濃度和純度。若符合試劑盒規定的標準，立即進行后續基因檢測步驟或置-20 ℃冰箱保存。

CYP3A4 基因位點多態性分析：1）引物設計。采用Primer Premier 6.0引物設計軟件設計，基因引物序列見表1。2）PCR 反應體系。反應體系共25.0 μL，包括脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）2.0 μL，10 × PCR 擴增緩沖液2.5 μL，10 μmol/L 濃度上下游引物各0.75 μL，PreMix Taq DNA 聚合酶3.0 μL，基因組DNA 2.0 μL，無核酸酶水定容至25.0 μL。3）PCR 擴增條件。95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環40次；72 ℃延伸2 min。4）電泳及測序分型。將2.0 μL限制性內切酶加入5.0 μL PCR 擴增產物內，37 ℃恒溫孵育7 h，加2%瓊脂糖凝膠進行Goldview染色，250 V電壓下電泳。陽性產物由濟南廣音醫療科技有限公司測序，采用Chromas 2.6.5軟件對基因序列進行比對分析，并確定基因型。

表1 基因引物序列Tab.1 Gene primer sequence

1.4 觀察指標與療效判定標準

觀察指標：1）臨床指標改善情況。包括腫脹關節數、壓痛關節數、晨僵時間、醫師評估視覺模擬評分法（VAS）評分、患者評估VAS 評分、健康狀況問卷（HAQ）評分。2）實驗室指標。包括血常規、尿常規、C反應蛋白、紅細胞沉降率、肝腎功能等［12］。3）安全性。統計治療期間RA組患者服用托法替布后的相關ADR發生情況。將ADR 的嚴重程度分為輕度、中度、重度3 個等級［13］，采用Karch和Lasagna評定法將ADR的因果關系判定為肯定、很可能、可能、條件、可疑5 級［14］。其中，肯定、很可能和可能3 級可作為ADR 的主要判定依據，以區分ADR 是由托法替布引起，而非由同服藥物引起。出現托法替布相關ADR 的RA 患者納入ADR 組，未出現托法替布相關ADR的RA患者納入無ADR組。

療效判定：采用美國風濕病學學會（ACR）制訂的ACR20 標準［12］評估。符合ACR20 標準即為改善；反之，為未改善。

1.5 統計學處理

采用SPSS 26.0 統計學軟件分析。計量資料以±s表示，行t檢驗；基因分型的頻率分布滿足Hardy -Weinberg 平衡采用χ2檢驗；組間的基因型與等位基因頻率的比較采用χ2檢驗；基因型為3組數據的分析采用Kruskal - Wallis 檢驗，基因型為2 組數據的分析采用Mann-Whitney檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因檢測結果

RA 組和對照組患者的CYP3A4*4，CYP3A4*18，CYP3A4*1G基因位點多態性均無顯著差異（P>0.05）。CYP3A4基因型分布與等位基因頻率比較見表2。

表2 RA組和對照組患者CYP3A4基因型分布與等位基因頻率比較［例（%）］Tab.2 Comparison of CYP3A4 genotype distribution and allele frequency between the RA group and the control group［case（%）］

2.2 CYP3A4 基因多態性與臨床療效的關系

根據療效評價結果，181 例RA 患者納入改善組，128 例納入未改善組。改善組和未改善組RA 患者的疾病活動度差異顯著（P<0.05），而CYP3A4*4，CYP3A4*18，CYP3A4*1G基因位點多態性均無顯著差異（P>0.05）。詳見表3。

表3 改善組和未改善組患者一般資料與CYP3A4基因型分布比較Tab.3 Comparison of the patient′s general data and CYP3A4 genotype distribution between the improved group and the non -improved group

2.3 ADR 發生情況

ADR組中，因果關系判定為肯定9例，很可能37例，可能12例；ADR嚴重程度為輕度51例，中度7例。詳見表4。

表4 ADR累及系統與臨床表現（n=58）Tab.4 ADR - involved systems and their clinical manifestations（n = 58）

2.4 CYP3A4 基因多態性與ADR 的關系

ADR 組和無ADR 組患者的CYP3A4*1G基因位點多態性差異顯著（P<0.05），而CYP3A4*4和CYP3A4*18基因位點多態性均無顯著差異（P>0.05）。詳見表5。

表5 ADR組和無ADR組患者一般資料與CYP3A4基因型分布比較Tab.5 Comparison of the patient′s general data and CYP3A4 genotype distribution between the ADR group and the non -ADR group

3 討論

3.1 CYP3A4 基因位點選擇

CYP3A4 基因序列突變率低，已發現能明顯影響酶功能活性的基因多態性位點亦較少［15］。國內外的研究顯示，在中國漢族人群中存在多態性并可能影響酶活性的CYP3A4 基因位點有CYP3A4*4 A13871G，CYP3A4*5 C15702G，CYP3A4*6 17661del，CYP3A4*18T20070C，CYP3A4*1G G20239A，CYP3A4*22 C15389T等。在中國人群CYP3A4 基因位點中，CYP3A4?1G是目前已知的突變率最高的位點，也是中國研究者研究最多的CYP3A4 基因位點。CYP3A4*4，CYP3A4*5，CYP3A4*6在中國漢族人群中有較低的突變率，突變后可顯著升高辛伐他汀的調血脂作用［16］。但CYP3A4*5和CYP3A4*6突變率均低于1%，本研究中受限于病例數量，并未將上述2 個位點納入研究。研究表明，CYP3A4*18在中國漢族人群中的突變率低于10%，并能引起氯吡硫磷與睪酮的代謝速率加快［17］。CYP3A4*22是近期發現的影響酶活性的多態性位點，在歐美人群中的突變率約為8%，而在非洲人群與亞裔人群中的突變率較低［18］。有研究顯示，CYP3A4*22基因位點的突變并不能引起辛伐他汀調血脂作用的改變，對酶活性無影響［19］，故本研究中未將CYP3A4*22基因位點納入研究。目前，尚無文獻明確報道CYP3A4 基因多態性是否對托法替布的體內代謝有影響。本研究中選取CYP3A4*4，CYP3A4*18，CYP3A4*1G基因位點，調查了江蘇南通地區漢族RA患者和健康人群的CYP3A4基因多態性，又考察了基因多態性對托法替布臨床療效及ADR的影響。

3.2 CYP 基因位點與臨床療效

RA 患者和健康人群的CYP3A4*4基因均未檢出突變純合型，G 等位基因突變率均低于1%；RA 患者和健康人群CYP3A4*18的C 等位基因突變率均低于4%。可見，CYP3A4*4和CYP3A4*18都是江蘇南通漢族人群突變率很低的位點。RA 患者和健康人群CYP3A4*1G的A等位基因突變率約為20%，呈現出較明顯的基因多態性，與文獻［20］報道的結果相似。RA 患者和健康人群間的CYP3A4*4，CYP3A4*18，CYP3A4*1G基因位點多態性均無顯著差異，提示RA 的發病與上述位點多態性無關。改善組和未改善組患者的疾病活動度差異顯著，而CYP3A4*4，CYP3A4*18，CYP3A4*1G基因位點多態性的差異均無顯著差異。可見，疾病活動度與托法替布的臨床療效有相關性，疾病活動度較低患者的藥物療效更好，托法替布更適用于中低疾病活動度的RA 患者。在CYP3A4?1G基因的相關研究中發現，與野生純合型比較，突變雜合型與突變純合型人群外周血單核細胞內CYP3A4 mRNA 的相對表達量顯著減少，CYP3A4?1G基因突變后可下調CYP3A4 mRNA 的表達，從而降低CYP3A4酶的活性［20］。YE等［21］研究了CYP3A4酶活性改變對托法替布代謝的影響，發現CYP3A4.1酶變體可導致托法替布的體內清除率顯著降低。本研究中所有RA患者的托法替布劑量均為藥品說明書推薦的每日2次，每次5 mg，劑量較大。由于CYP3A4?1G基因突變會引起CYP3A4酶活性降低，在CYP3A4酶活性正常或降低時，托法替布的血藥濃度處于正常或升高水平，療效較好。

3.3 CYP3A4 基因位點與ADR

本研究結果顯示，ADR組和無ADR組的CYP3A4*1G位點多態性差異顯著，而CYP3A4*4和CYP3A4*18基因位點多態性無顯著差異，提示CYP3A4*1G基因位點突變與托法替布所致ADR 有相關性。CYP3A4?1G是具有功能意義的突變，CYP3A4酶活性在CYP3A4?1G基因位點突變后下降，該酶的代謝能力減弱，引起托法替布血藥濃度升高，發生ADR。由于CYP3A4*4和CYP3A4*18基因位點的突變率較低，并未觀察到二者對托法替布ADR的影響。

3.4 臨床應用與本研究局限性

CYP3A4*1G基因多態性和托法替布治療RA 的ADR 有相關性，建議臨床應用托法替布時監測CYP3A4*1G基因多態性。對于CYP3A4?1G突變雜合型和突變純合型的RA 患者，必要時適當降低劑量，以保證用藥安全。此外，臨床用藥應考慮患者是否同時應用影響CYP3A4 酶活性的藥物和飲食。酮康唑等強效CYP3A4 酶抑制劑會抑制托法替布的體內代謝，導致托法替布暴露量增加，可小劑量給藥，每日1次，每次5 mg；利福平等強效CYP3A4 酶誘導劑會加快托法替布的體內代謝，導致托法替布暴露量減少，甚至可能導致藥理作用喪失，可較大劑量給藥，每日2 次，每次5 mg，或避免與強效CYP3A4酶誘導劑同時使用。

本研究存在以下局限性：1）由于部分醫師對藥物基因檢測的認知度不足，以及檢測費用較高，導致納入本研究的病例數較少；2）本研究為單中心臨床研究，且部分位點的突變率低，可能影響研究結論的可靠性；3）CYP3A4 基因多態性與托法替布臨床療效的相關性研究的樣本量較小，研究數據不充分，所有位點均未得出有顯著差異的結果，這與真實世界可能存在偏差。后續研究中，要擴大病例數量，聯合多中心研究探討中國人群CYP3A4基因多態性對托法替布臨床療效的影響；結合相關基因檢測和托法替布血藥濃度監測結果，全面地評價藥物的有效性和安全性。