苦參堿對骨肉瘤細胞凋亡的影響*

王利寧，趙新芝，宋軍帥，王淑燕，孫廣玉，李克明，楊真真

（1.山東省乳山市人民醫院，山東威海 264599； 2.山東省中醫藥研究院，山東濟南 250014； 3.山東省濱州市人民醫院，山東濱州 256600； 4.山東省濟南市第四人民醫院，山東濟南 250031）

骨肉瘤（OS）是兒童和青少年最常見的原發性骨癌，是繼軟骨肉瘤和脊索瘤后第三大常見骨癌，具有極強的侵襲性和破壞性，臨床表現為腫瘤、疼痛、跛行等［1-2］。且在確診后的1 年內有80%～90%的患者會出現肺轉移［3-6］，轉移后患者的5 年生存率僅有20%～30%［7-9］。目前，OS的發病機制并未闡明。OS發生早期，主要應用手術切除，但預后較差；化學治療（簡稱化療）有一定的作用，但會產生嚴重的骨髓抑制、肝腎功能障礙及高耐藥性［10-11］。中藥單體在臨床腫瘤治療上發揮了積極作用。苦參堿提取自苦參，具有抗腫瘤、抗炎、調節免疫等作用［12-13］，能抑制多種腫瘤細胞生長［14］，如通過糖代謝途徑抑制胃癌細胞轉移［15］。多項研究表明，苦參堿可通過調控絲氨酸/ 蘇氨酸蛋白激酶（AKT）、Bcl-2關聯X蛋白（Bax）等因子的表達，而抑制人OS細胞的增殖與凋亡［16-21］。細胞外信號調節激酶5（ERK5）屬有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，對細胞存活、增殖、遷移、分化等多項生物反應均有調節作用［22］，可通過金屬蛋白酶9（MMP - 9）調節OS 細胞的侵襲性［23］，經磷酸化后還可參與細胞凋亡［24］。絲裂原激活蛋白激酶5（MEK5）是ERK5的唯一調節因子，激活后對下游效應因子c-myc 和Nur77 具有調節作用［25］，其中c-myc、胱天蛋白酶9（caspase- 9）在細胞周期中扮演重要角色［26］，可激活多種信號靶點，并促進細胞凋亡［27］。為此，本研究中探討了苦參堿對ERK5信號通路的調控作用及機制，以期為OS的治療提供思路。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥、細胞與動物

儀器：Imark - 22353 型多功能酶標儀，PowerPac Basic 電泳儀，均購于美國Bio - Rad 公司；C6 Plus 型流式細胞儀（美國BD Bioscience 公司）；CFX 96 型熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）儀（Bio - Rad Laboratories，Inc.）；Hema 9600 型基因擴增儀（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；Ni-V 型研究級正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；Tanon5200 型全自動化學發光圖像分析儀（上海天能科技有限公司）。

試藥：苦參堿（陜西金康泰生物科技有限公司，CAS號為519 - 02 - 8，純度為98%）；CCK - 8 試劑盒（批號為A311 - 02 - AA），凋亡試劑盒（批號為A211 - 02），均購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DMEM 培養基（HyClone，批號為SH3002201），胎牛血清（Biological Industries，批號為04 - 001 - 1ACS），c - myc（批號為A1309，稀釋比例為1∶1 000），caspase - 9（批號為A11910，稀釋比例為1∶1 000），Nur77（批號為A6676，稀釋比例為1∶1 000），均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；內參三磷酸甘油脫氫酶（GAPDH，批號為10494-1-AP，稀釋比例為1∶20 000），MEK5磷酸化抗體（批號為15758-1-AP，稀釋比例為1∶1 000），均購于武漢三鷹生物技術有限公司；二抗（Cell Signaling Technology，批號為#7074，稀釋比例為1∶1 000）；XMD - 892（Creative Enzymes，批號為CEL-1585）；熒光二抗（Cell Signaling Technology，4412S，稀釋比例為1∶100）；熒光定量PCR 相關試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），引物由北京擎科生物科技有限公司設計，引物序列見表1。

表1 mRNA擴增的基因引物序列Tab.1 Geneprimer sequences for mRNA amplification

細胞：人成骨肉瘤細胞株MG-63（ATCC）。

動物：雄性SPF 級SD 大鼠20 只，6～8 周齡，體質量160～200 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，動物生產許可證號為SCXK（魯）20190003。飼養于室溫25 ℃、相對濕度50%～60%、每12 h明暗交替的環境中，均自由攝食、飲水。本研究中動物實驗程序均經實驗動物福利與倫理委員會批準，實驗過程中的所有操作均符合“3R”原則。

1.2 方法

苦參堿含藥血清制備：SD 大鼠適應性喂養1 周后，隨機分為0 濃度組和10%苦參堿組，各10 只，分別灌胃生理鹽水和10%苦參堿，每日2 次，連續3 d。第3 天灌胃前，禁食不禁飲12 h，于末次給藥1 h 后，腹腔注射麻醉藥物，腹主動脈取血；血樣于4 ℃條件下離心（轉速為3 000 r/min）10 min，收集上層血清，于56 ℃水浴中滅活30 min，0.22 μm微孔濾膜濾過，保存于-80 ℃冰箱，待用。

細胞培養：細胞接種于加10%胎牛血清DMEM 培養基中，于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。后續實驗均基于對數生長期的細胞開展，均重復3次。

CCK-8法檢測苦參堿對MG-63細胞增殖的影響：將細胞混懸液接種至96孔板中，每孔100 μL，培養24 h后，加入0 濃度組和10%苦參堿組的苦參堿含藥血清。分別于培養24，48，72，96 h 時加入CCK - 8 試劑，于37 ℃恒溫培養箱中繼續培養40 min，觀察液體顏色是否變黃。采用酶標儀于450 nm波長處檢測各孔的吸光度（OD）值，計算細胞活力。細胞活力（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。

流式細胞術檢測苦參堿對MG-63細胞凋亡的影響：將細胞混懸液接種至6孔板中培養24 h后棄去廢液，加入0 濃度組和10%苦參堿組苦參堿含藥血清干預48 h后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次，離心，棄去上清液，輕輕吹打，加300 μL 的1×Bind buffer 到細胞中，重懸。按試劑盒說明書依次加入Annexin V（FITC，5 μL）和碘化丙啶（PI，5 μL），避光孵育15 min，于1 h 內用流式細胞儀測定細胞凋亡數，計算細胞凋亡率。細胞凋亡率（%）=（早期凋亡細胞數+ 晚期凋亡細胞數）/總細胞數×100%。

定量PCR檢測MG-63細胞凋亡相關基因轉錄情況：將細胞接種至6 孔板中，培養24 h 后加入0 濃度組和10%苦參堿組苦參堿含藥血清，干預48 h，提取總RNA，按Vazyme 逆轉錄及PCR 試劑盒說明書，在熒光定量PCR 儀上進行PCR 擴增檢測。以β-肌動蛋白（βactin）為內參，用2-ΔΔCt公式計算目的基因（c - myc，caspase-9）的相對表達水平。

免疫印跡（Western blot）法檢測MG - 63 細胞蛋白表達水平：前期研究證明，苦參堿可抑制ERK5 蛋白信號的表達，且MEK5 是ERK5 信號通路的唯一激活劑［28］；Nur77 又受ERK5 調控，本研究中檢測MEK5 和Nur77 蛋白表達水平。細胞接種于6 孔板中，分為0 濃度組和10%苦參堿組，探討苦參堿促凋亡的分子機制；分為0濃度組，10%苦參堿組，XMD8-92組，10%苦參堿+XMD8 - 92 組，探討苦參堿通過ERK5 信號通路調控MG - 63 細胞凋亡的作用；分為0 濃度組，10%苦參堿組，vector 組（10%苦參堿+ CMV - MEK5aCA），MEK5組（CMV - MEK5aCA），探討過表達ERK5 信號通路上游蛋白MEK5時苦參堿如何調控細胞凋亡。分別培養24 h后，提取總蛋白，制備上樣緩沖液，取30 μg 蛋白上樣，電泳條件設置為恒壓80 V、30 min，后轉為120 V、60 min，轉膜條件設置為恒流180 mA、120 min，用5%脫脂牛奶封閉2 h，待封閉結束用TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，4 ℃條件下一抗孵育過夜，回收一抗TBST緩沖液清洗3次，每次10 min，加入二抗，室溫慢搖2 h。繼續清洗，使用電致化學發光（ECL）劑在凝膠成像系統中進行顯影分析。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0.2（263）軟件進行數據分析及統計作圖。數據以±s表示，組間比較采用one -way ANOVA分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 降低MG-63 細胞活力

與0 濃度組相比，隨著藥物作用時間的延長，10%苦參堿組OD值增速逐漸變小，提示細胞活力被逐漸抑制，苦參堿能抑制MG-63細胞增殖，且呈時間依賴性。詳見圖1和表2。

圖1 CCK-8法檢測不同濃度苦參堿含藥血清對MG-63細胞增殖的影響Fig.1 Effect of different concentrations of matrine - containing serum on the proliferation of MG - 63 cells detected by the CCK - 8 method

表2 不同濃度苦參堿組不同時間OD值比較（±s）Tab.2 Comparison of OD values in matrine groups with different concentrations at different times（±s）

表2 不同濃度苦參堿組不同時間OD值比較（±s）Tab.2 Comparison of OD values in matrine groups with different concentrations at different times（±s）

時間第1天第2天第3天第4天0濃度組0.667±0.074 6 1.544±0.135 2.211 25±0.153 2.775 5±0.233 10%苦參堿組0.447±0.129 1.313 5±0.303 1.802 25±0.11 2.090 5±0.112

2.2 促進MG-63 細胞凋亡

與0濃度組相比，10%苦參堿組細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），提示苦參堿能顯著促進MG-63 細胞凋亡。詳見圖2。

A.流式散點圖 B.柱狀圖注：與0濃度組相比，**P < 0.01，***P < 0.001。圖3至圖6同。Q1 - LR為早期凋亡細胞，Q1 - UR為晚期凋亡細胞。圖2 苦參堿對MG-63細胞凋亡率的影響A.Flow scatter B.Bar chartNote：Compared with those in the non - matrine group，**P < 0.01 and ***P < 0.001（for Fig.2 - 6）.Q1 - LR refers to early apoptotic cells，and Q1 - UR refers to late apoptotic cells.Fig.2 Effect of matrine on the apoptosis of MG - 63 cells

2.3 調控MG-63 細胞凋亡相關基因轉錄水平

與0 濃度組相比，10%苦參堿組caspase-9 基因表達水平顯著升高（P<0.01），c-myc基因表達水平顯著降低（P< 0.001），表明苦參堿能通過調控凋亡相關基因促進細胞凋亡。詳見圖3。

A.caspase - 9 B.c - myc圖3 定量PCR檢測凋亡相關基因表達A.caspase - 9 B.c - mycFig.3 Detection of apoptosis - related gene expression by the RT - PCR

2.4 抑制ERK5 信號通路相關蛋白表達

與0濃度組相比，10%苦參堿組MEK5和Nur77蛋白表達水平均顯著降低（P<0.001），表明苦參堿對ERK5信號通路中上下游蛋白具有明顯調控作用。詳見圖4。

A.電泳圖 B - C.蛋白計數圖圖4 Western blot法檢測MEK5和Nur77蛋白表達情況A.Electropherogram B - C.Protein countFig.4 Detection of MEK5 and Nur77 protein expression by the Western blot

2.5 通過ERK5 信號通路調控MG-63 細胞凋亡

與0 濃度組相比，10%苦參堿組、XMD8 - 92 組、10%苦參堿+XMD8-92 組c-myc 蛋白表達水平顯著降低（P<0.01），XMD8-92組、10%苦參堿+XMD8-92組caspase-9蛋白表達水平顯著升高（P<0.001），表明苦參堿與ERK5 抑制劑XMD8 - 92 具有相似性，對ERK5信號通路具有抑制作用。詳見圖5。為進一步證明苦參堿通過ERK5 信號通路調控MG-63 細胞周期與凋亡，通過過表達唯一上游蛋白MEK5，并檢測c - myc 和caspase - 9 蛋白表達水平進行驗證。與0 濃度組相比，10%苦參堿組c-myc蛋白表達水平顯著降低（P<0.001），caspase-9 蛋白表達水平顯著升高（P<0.001）。與vector 組相比，MEK5 組c - myc 蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），caspase-9蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。表明ERK5 對MG-63 細胞凋亡具有調控作用，蛋白表達與細胞凋亡呈負相關。詳見圖6。

3 討論

OS是臨床常見惡性腫瘤，好發于青少年發病率高，存活率低［22］。目前治療手段主要為手術治療與化療，但患者預后效果差，生活質量低，且常伴隨耐藥與疾病復發率高的困擾［27］。因此，抑制腫瘤生長及緩解化療耐藥是當前亟待解決的問題，使腫瘤細胞凋亡是解決以上問題的重要手段［24-25］。

苦參始見于《神農本草經》，用于治療癥瘕積聚。主要成分為苦參堿［27-28］。現代藥理學研究發現，苦參堿通過信號轉導與轉錄活化因子3（STAS3）通路增強阿霉素化療對OS的療效［29］，能促進OS細胞凋亡［30］。與順鉑治療小鼠OS相比，高濃度苦參堿能明顯減少腫瘤質量，誘導腫瘤組織凋亡，其主要作用途徑可能與FAS/FASL的表達及與caspase-8 的活化有關。鄒敏等［17］、李國慧等［15］將苦參堿作用于MG - 63 細胞后，發現細胞增殖能力下降，其主要原因為細胞凋亡率升高，與本研究結果一致。此外，尚劍等［16］發現苦參堿抑制MG - 63 細胞DNA 合成，阻滯細胞在S 期，同時激活caspase - 3，caspase-8，caspase-9蛋白的表達，從而導致細胞程序性死亡。Caspase 家族在細胞凋亡過程中被激活［31-32］，參與內源性與外源性凋亡途徑［33-36］。外源性凋亡以線粒體途徑為主，caspase-9作為本途徑的啟動蛋白發揮重要作用［37-38］。

細胞凋亡率降低是化療耐藥性產生的重要因素，因藥物促進細胞凋亡是OS治療的研究熱點。研究表明，ERK5 屬MAPK 家族，在細胞存活、增殖、遷移、分化等多項生物反應中具有調節作用［39-40］。MEK5處于ERK5的上游，是其唯一調節因子，ERK5 激活后對下游效應因子c-myc 和Nur77 具有調節作用［24］，c-myc 在細胞周期中扮演重要角色［25］，其激活后可激活多種信號靶點促進細胞凋亡［26］。有研究表明，ERK5 磷酸化后調節Nur77可參與細胞凋亡［27］。

本研究結果顯示，苦參堿對細胞增殖的抑制作用明顯，同時對細胞凋亡有顯著促進作用。抑制細胞周期標志性蛋白c - myc 表達，而對線粒體凋亡啟動蛋白caspase-9 具有明顯激動作用。c-myc 蛋白表達下調，抑制細胞周期活性，啟動細胞凋亡信號通路，從而抑制細胞增殖，促進凋亡。為驗證苦參堿通過ERK5 信號通路調控MG - 63 細胞凋亡，分別加入ERK5 抑制劑XMD8-92、過表達其上游信號MEK5。過表達MEK5，周期蛋白c-myc降低，凋亡蛋白caspase-9上升；加入ERK5抑制劑XMD8-92后，c-myc上升，caspase-9下降。可見，苦參堿作用于MG-63細胞的效果與抑制劑XMD8-92相當，且XMD8-92聯合苦參堿的效果更明顯。

綜上所述，苦參堿通過ERK5信號通路調控MG-63細胞凋亡及相關蛋白caspase - 9 和c - myc 的表達。本研究結果可為OS 的治療提供新思路，拓展中醫藥治療惡性疾病的研究方向。