利伐沙班對氧化型低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞功能的影響*

袁 媛，劉 遲，李光慧，張曉丹，王利蘋，黃仲義，王 斌，2△

（1.上海市靜安區中心醫院，上海 200040； 2.復旦大學附屬華山醫院，上海 200040）

動脈粥樣硬化是心腦血管事件的重要發病機制，其發生、發展與內皮細胞功能紊亂、脂質聚積和炎癥進展密不可分［1］。有研究顯示，由脂質誘發的人內皮細胞損傷是動脈粥樣硬化的始動環節［2］。氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL）可通過減少增殖、促進凋亡和引發炎癥而引起內皮細胞功能障礙［3］。利伐沙班（RIV）是非維生素K拮抗劑口服抗凝劑（NOAC）的代表藥物［4］，不僅可預防栓塞性中風，還可減少心血管事件，如冠狀動脈及外周血管疾病、血栓栓塞癥和動脈粥樣硬化［5-6］。部分研究對RIV可能具有減少內皮功能損傷的潛力這一假設進行了驗證，發現RIV可減少脂多糖（LPS）、［4-（（氨基甲酰基硫基）甲基）苯基］硼酸氫溴酸鹽、內毒素或氧甾醇引起的炎性因子或凋亡細胞的數量［7-10］。為此，本研究中探討了RIV 對Ox-LDL 刺激下內皮細胞功能障礙的影響及可能的機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細胞

儀器：Forma3111 型細胞培養箱（美國Thermo 公司）；EPOCH 型酶標儀（美國BioTek 公司）；BSC - 1600 IIA2 型生物安全柜（蘇州安泰空氣技術有限公司）；FACSClibur 型流式細胞儀（美國BD 公司）；2500 型凝膠成像儀（上海天能公司）；Mini-PROTEAN 型垂直電泳儀（美國BioRad公司）。

試藥：RIV（上海阿達瑪斯試劑有限公司，批號為P1263035，純度為99.9%）；Ox-LDL（廣州奕源生物工程公司，貨號為YB-002）；DMEM 培養液（美國Hyclone公司，批號為AF29585038）；胎牛血清（批號為42F6590K），胰酶（批號為批號04054），均購自美國Gibco Thermo公司；青霉素（100 U/mL）-鏈霉素（100 μg/mL）溶液（上海碧云天生物技術有限公司，批號為080420200826）；細胞計數試劑盒（CCK-8，北京蘭杰柯科技有限公司，批號為71011500）；膜聯蛋白- 熒光素異硫氰酸酯/碘化丙啶Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒（批號為A20843），腫瘤壞死因子- α（TNF - α），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（批號為A18211134），白細胞介素6（IL - 6）ELISA 試劑盒（批號為A10610732），均購自廣州聯科生物科技有限公司；白細胞介素1β（IL - 1β）ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號為VC8IKL2PYR）；十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS - PAGE）預制膠（上海天能科技有限公司，批號為072220100803）；無蛋白快速封閉液（上海雅酶生物科技有限公司，批號03551200）；兔尿激酶型纖溶酶原激活因子受體（uPAR）抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號為00082384）；核因子-κB（NF-κB）p65抗體（批號為16），p-NF-?B p65 抗體（批號為17），均購自美國Cell Signaling Technology 公司；β- 肌動蛋白（β- actin）抗體（批號為T0002），山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG，批號為56j9958），均購自常州祥泰生物技術有限公司；山羊抗鼠IgG 抗體（美國Jackson公司，批號為140586）。

細胞株：人臍靜脈內皮細胞株（HUVEC）由復旦大學藥學院微生物與生化藥學教研室饋贈。

1.2 方法

細胞培養：從液氮中取出HUVEC 細胞株1 支進行細胞復蘇，使用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM 培養液，將復蘇后的HUVEC 分裝于T25 細胞培養瓶中，將細胞置5% CO2、37 ℃的培養箱中，培養24 h后更換新鮮培養液。當細胞培養至對數生長期（融合度約為80%）時進行傳代培養或細胞計數。

細胞分組與處理：條件培養24 h 后，根據不同干預措施將HUVEC 分為空白對照組（A 組，常規培養液），Ox-LDL 組（B 組，含100 μg/mL Ox-LDL 的培養液），Ox - LDL + RIV125 組（C1組，含100 μg/ mL Ox - LDL和125 ng/ mL RIV 的培養液），Ox - LDL + RIV250 組（C2組，含100 μg/mL Ox-LDL 和250 ng/mL RIV 的培養液）和Ox - LDL + RIV500 組（C3組，含100 μg/ mL Ox-LDL和500 ng/mL RIV的培養液）。用RIV 20 mg/ d劑量預防中風時，患者血漿濃度峰值為249（184～343）ng/mL，谷濃度為44（12～137）ng/mL［11］。10 mg/d或20 mg / d 劑量治療靜脈血栓時，患者最大血漿濃度為101（7～273）ng/mL或215（22～535）ng / mL，最低血漿濃度為14（4～51）ng / mL 或32（6～239）ng/mL［12］。經換算，C1組、C2組、C3組分別給予125，250，500 ng/mL質量濃度RIV。

CCK-8法檢測細胞存活率：取對數生長期細胞，以1 000個/孔的濃度接種到96孔板，每孔200 μL培養液，置培養箱中培養24 h，棄去上清液，進行分組處理，每組設6個復孔，繼續培養48 h，棄去培養液，每孔加入100 μL培養液和10 μL CCK - 8 溶液，避光持續培養1.5 h。利用酶標儀于450 nm 波長處讀取吸光度，重復3 次。以A 組的細胞存活率為100%，計算各組細胞存活率。

流式細胞儀檢測細胞凋亡率：取對數生長期細胞，以2.5×104個/孔的濃度接種至12 孔板，每孔1 mL 培養液，置培養箱中培養24 h，棄去上清液，進行分組處理，每組設3 個復孔，繼續培養48 h，收集各組細胞，置1.5 mL離心管中，使用預冷的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）離心洗滌，使用Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒，將細胞重懸于500 μL 1×結合緩沖液中，并于每管中加入5 μL Annexin V - FITC 和10 μL PI，室溫避光孵育5 min。利用流式細胞儀檢測細胞的熒光情況，采用FlowJo V10軟件分析。以Annexin V-FITC 染色陽性和PI染色陰性或陽性的細胞百分比計算細胞早期和晚期的凋亡率。

ELISA 測定細胞炎性因子水平：取對數生長期細胞，以1.0×105個/孔接種至6孔板，每孔2 mL培養液，置培養箱中培養24 h 棄去上清液，進行分組處理，每組設3 個復孔，繼續培養48 h，收集各組細胞培養上清液，離心（離心力為1 000g）20 min，進一步除去雜質和細胞碎片，取上清液。按ELISA 試劑盒說明測定IL - 1β，IL-6，TNF-α水平。

免疫印跡（Western blot）法測定NF-κB信號通路與uPAR蛋白的表達：取對數生長期細胞，以1.0×105個/孔接種至6孔板，每孔2 mL培養液，置培養箱培養24 h，置無菌操作臺，棄去上清液，用預冷的無菌PBS 洗滌2遍，每孔分別加入100 μL裂解液（含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑）于冰上裂解，收集裂解液，于4 ℃離心（離心力為14 000g）5 min 后留取上清液，采用BCA 法測定蛋白濃度［13］，根據樣品濃度與一定濃度的上樣緩沖液混合，4 ℃低速離心后，高溫變性，混勻，分裝，置-20 ℃冰箱。每孔上樣20 μg蛋白，使其在4%～20%的SDS-PAGE 中進行電泳，分離后的蛋白通過濕法電轉法轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上［14］，用無蛋白快速封閉液封閉30 min 后，4 ℃溫下下與一抗孵育過夜，包括μPAR（稀釋濃度為1∶800），NF-κB p65和p-NF-κB p65（稀釋濃度均為1∶1 000），內參蛋白β-actin（稀釋濃度為1∶5 000）。孵育后PVDF 膜用含0.1%吐溫20（Tween-20）的緩沖液洗滌3次，每次5 min，與二抗室溫孵育1.5 h。使用增強型化學發光試劑盒，通過凝膠成像系統顯影、拍照。采用Image J軟件檢測蛋白灰度值。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 9 軟件對數據進行分析。計量資料以±s表示，采用Shapiro-Wilk 檢驗獲取正常分布，組間分析采用單因素方差分析（ANOVA）和Dunnett多重比較檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對細胞存活率的影響

與A組比較，B組細胞存活率顯著降低（P<0.001）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組細胞存活率顯著升高（P<0.05），且呈劑量依賴關系。詳見圖1。

注：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，F = 9.484，P = 0.002 0。圖3同。圖1 RIV對Ox-LDL誘導的HUVEC細胞存活率的影響（n=3）Note：*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，F = 9.484，P = 0.002 0（for Fig.1 and Fig.3）.Fig.1 Effect of rivaroxaban on the survival rate of HUVEC cells induced by Ox - LDL（n = 3）

2.2 對細胞凋亡率的影響

與A組比較，B組細胞凋亡率顯著升高（P<0.01）；與B 組比較，C1組、C2組、C3組細胞凋亡率均顯著降低（P<0.05）。詳見表1和圖2。

表1 RIV對Ox-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡率的影響（±s，%，n=3）Tab.1 Effect of rivaroxaban on apoptosis rate of HUVEC cells induced by Ox - LDL（±s，%，n = 3）

表1 RIV對Ox-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡率的影響（±s，%，n=3）Tab.1 Effect of rivaroxaban on apoptosis rate of HUVEC cells induced by Ox - LDL（±s，%，n = 3）

注：與A組比較，#P < 0.05，##P < 0.01；與B組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。表2同。Note：Compared with those in group A，#P < 0.05，##P < 0.01；Compared with those in group B，*P < 0.05 and **P < 0.01 （for Tab.1 - 2）.

組別A組B組C1組C2組凋亡率4.46±2.95 17.45±3.39##11.84±2.53*10.65±3.38*組別C3組F值P值凋亡率9.71±1.52*8.055 0.003 6

圖2 RIV對Ox-LDL誘導的HUVEC細胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of rivaroxaban on apoptosis rate of HUVEC cells induced by Ox - LDL

2.3 對細胞炎性反應的影響

與A組比較，B組細胞IL-1β，IL-6，TNF-α水平均顯著升高（P<0.05）；與B 組比較，C3組細胞IL-1β，IL-6，TNF-α水平均顯著降低（P<0.05）。詳見圖3。

A.IL - 1β（F = 6.742，P = 0.006 7） B.IL - 6（F = 12.68，P = 0.007） C.TNF - α（F = 3.59，P = 0.045 7）圖3 RIV對Ox-LDL誘導的HUVEC IL-1β，IL-6，TNF-α水平的影響A.IL - 1β（F = 6.742，P = 0.006 7） B.IL - 6（F = 12.68，P = 0.007） C.TNF - α（F = 3.59，P = 0.045 7）Fig.3 Effect of rivaroxaban on IL - 1β，IL - 6 and TNF - α levels of HUVEC cells induced by Ox - LDL

2.4 對細胞NF-κB p65 表達的影響

與A 組比較，B 組細胞p-NF-κB p65 表達顯著升高（P< 0.05）；與B 組比較，C3組p - NF - κB p65 表達顯著降低（P<0.05）。詳見表2和圖4 A。

表2 RVI對Ox-LDL誘導的HUVEC NF-κB p65和uPAR蛋白表達水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of NF - κB p65 and uPAR protein expression levels in HUVEC cells induced by Ox - LDL（±s，n = 3）

表2 RVI對Ox-LDL誘導的HUVEC NF-κB p65和uPAR蛋白表達水平比較（±s，n=3）Tab.2 Comparison of NF - κB p65 and uPAR protein expression levels in HUVEC cells induced by Ox - LDL（±s，n = 3）

組別A組B組C1組C2組C3組F值P值p-NF-κB p65/ NF-κB p65 0.78±0.12 1.38±0.51#0.96± 0.15 0.82±0.09 0.59±0.07*4.172<0.05 uPAR/β-actin 0.75 ±0.05 0.98 ±0.02##0.74 ±0.15**0.84 ±0.07*0.43±0.07**49.03<0.001

A.NF - κB p65 B.uPAR圖4 RIV對Ox-LDL誘導的HUVEC NF-κB p65通路和uPAR的免疫印跡電泳圖A.NF - κB p65 B.uPARFig.4 Immunoblot electropherograms of NF - κB p65 pathway and uPAR of HUVEC cells induced by Ox - LDL

2.5 對細胞uPAR 表達的影響

與A組比較，B組細胞uPAR蛋白表達水平顯著升高（P<0.001）；與B組比較，C1組、C2組、C3組細胞μPAR蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05）。詳見表2和圖4 B。

3 討論

RIV 是一種具有研究價值和臨床應用前景的新型血管保護劑。COMPASS 研究［15］結果表明，RIV 2.5 mg每日2 次可降低慢性血管性疾病患者的心血管事件發生風險，且嚴重不良反應較少［16］。另一項隨機試驗研究結果表明，與單用阿司匹林相比，RIV 5 mg 每天2 次可增加缺血后前臂血流量，減少亞臨床炎性表現，改善2型糖尿病患者的內皮功能退化［17］。

作為動脈粥樣硬化的獨立風險因素，Ox - LDL 能降低血管內皮活性，進而誘發凋亡和產生炎癥，繼而導致病變部位形成不穩定斑塊，以及斑塊破裂后引發急性冠狀動脈綜合征［18-19］。因此，Ox - LDL 作為建立細胞損傷模型的關鍵誘導因子在心血管藥理研究中得到了廣泛應用［20］。本研究中利用Ox-LDL 誘導內皮細胞產生細胞損傷，繼而研究了RIV 在增加細胞活力、抑制凋亡和炎性因子分泌方面的表現。結果發現，RIV 可通過提高細胞存活率，減少細胞凋亡數目，減少HUVECs細胞中炎性因子IL-1β，IL-6，TNF-α 的分泌，調節HUVEC 細胞中p - NF - κB p65 和uPAR 的表達，從而發揮細胞內皮保護功能。

本研究中選擇的濃度（125，250，500 ng/ mL）均在RIV 的治療濃度范圍內［11-12］，均緩解了Ox-LDL 誘導的細胞活力下降，其中250 ng/ mL 和500 ng/ mL 減少了細胞凋亡，且500 ng/mL RIV還可進一步減少IL-1β，IL-6，TNF-α 的分泌，提示RIV 的內皮功能保護作用可能是劑量依賴性的。一項大鼠抑郁癥模型實驗中，RIV 既減少了炎性反應，又以劑量依賴的方式減少了氧化應激［21］。另一項小鼠體內實驗結果表明，RIV 和阿司匹林可減少Ldlr 敲除小鼠病灶中的細胞凋亡［22］。研究表明，無論是100 ng/mL 或500 ng/mL RIV，還是25 -羥基膽固醇，對內皮細胞凋亡都未產生任何影響［23］，這提示RIV 對凋亡的影響可能與誘發細胞損傷的因素有關。

NF - κB 途徑的激活有助于促炎因子的分泌和細胞凋亡，從而進一步促進內皮細胞的損傷和動脈粥樣硬化［24］。本研究中RIV明顯抑制了Ox-LDL誘導的NF-κB p65磷酸化水平，這與使用LPS 和舒尼替尼的研究結果［25］一致。因此，提示RIV 可能通過抑制NF - κB p65 的激活以保護內皮功能。

μPAR 是一種多功能調節受體，通常存在于內皮細胞、成纖維細胞和多種腫瘤細胞表面［26］，與細胞增殖、分化、遷移、炎性反應等密切相關［27-30］。已有研究表明，功能受損的內皮細胞中μPAR 的表達上調，同時缺血性腦卒中患者的血漿中也檢測到可溶性μPAR 水平升高［31］。一些心血管藥物如決奈達隆和依折麥布，可能通過減少內皮細胞上的μPAR 表達而表現出心血管保護作用［30-31］。本研究中發現，RIV 對HUVEC 細胞中的μPAR 顯示出抑制作用，表明μPAR 可能是RIV 減輕內皮細胞損傷的另一個靶點?；讦蘌AR 的多重生理功能，推測下調μPAR 的RIV 可能具有抗凝外的其他藥理功能，如抗腫瘤作用。最新研究發現，RIV 在口腔鱗狀細胞癌（OSCC）細胞系（h357/H400）中均表現出抗腫瘤作用［32-33］。盡管還需研究，但RIV 甚至其他NOACs 的抗凝藥理作用無疑是一個極具研究潛力和價值的領域。

綜上所述，RIV 可減輕Ox-LDL 誘導的HUVEC 細胞存活率下降、凋亡增加、炎性因子分泌等損傷，且這種作用可能依賴于NF-κB 和μPAR 的調節。盡管需要進一步研究如在動物模型上證實等，進而深入闡明保護作用和機制，但本研究仍為探索RIV或其他NOAC在Ox-LDL 誘導的內皮細胞功能減退中的作用及其他額外臨床獲益提供了啟示。