全自動陰道分泌物分析系統復檢規則制訂及驗證的多中心研究

陸庭嫣,王 萍,曹永彤,渠 巍,劉 怡,楊軍蘭,王麗濱,陳曉軍,呂林佳,唐振華△

1.上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院檢驗科,上海 200030;2.中日友好醫院檢驗科,北京100029;3.貴陽市婦幼保健院檢驗科,貴州貴陽 550003;4.西北婦女兒童醫院醫學檢驗中心,陜西西安 710061;5.長春市婦產醫院檢驗科,吉林長春 130022

陰道分泌物顯微鏡鏡檢技術是婦科檢查的常規項目,是女性常見下生殖道感染性疾病診斷的重要依據[1]。隨著機器視覺識別技術及深度學習技術的發展,醫學顯微細胞圖像處理技術逐漸從傳統人工鏡下識別向計算機自動目標識別和分類的方向發展,并已成熟應用于各類體液檢驗[2]。自動化陰道分泌物分析系統將標本有形成分智能化識別,同時搭載干化學酶一體化檢測,有效提升了陰道分泌物病原篩查的效率,并能夠實現檢驗過程質量管理標準化。但由于陰道分泌物有形成分的復雜性和多樣性[3],以及干化學功能酶的局限性[4-6],當二者結果聯合判讀審核有疑惑時人工顯微鏡鏡檢確認仍是必不可少的手段。如何使自動化儀器發揮最大效率減輕人工壓力而又盡量避免漏診、誤診,成為當前關注的焦點。本多中心研究應用國際通用復檢規則評估指標[7-8]對全自動陰道分泌物分析系統進行復檢規則的制訂和驗證,以提高疾病篩查的準確性。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集2021年7月至2022年7月上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院檢驗科、中日友好醫院檢驗科、貴陽市婦幼保健院檢驗科、西北婦女兒童醫院醫學檢驗中心、長春市婦產醫院檢驗科的常規陰道分泌物檢測標本4 155份。為了使納入研究的標本與常規工作一致,且驗證結果能與實際應用情況更為符合,因而對標本送檢科室來源及患者年齡不做限制要求,連續隨機納入每天不超過50個。標本采集部位及方法參照《陰道分泌物臨床檢驗與結果報告規范化指南》[9]。

1.2儀器與試劑 GMD-S600婦科分泌物分析系統(長春迪瑞)及其配套試劑、校準物和質控品;Olympus光學顯微鏡;革蘭染色試劑(珠海貝索)。GMD-S600分析儀使用前參考尿液分析儀行業標準及廠方內控標準進行校準驗證,每日開機通過室內質控后方可進入標本檢測程序。

1.3方法

1.3.1標本處理 采集后的標本1 h內進行GMD-S600全自動儀器檢測,檢測結果留存備份。對儀器檢測報陽圖譜進行人工審核并記錄結果(陽性/陰性/有待鏡檢確認)。儀器檢測后的剩余標本混勻后,用一次性滴管等量滴加兩張玻片。一張濕片加載蓋玻片后供人工鏡檢進行白細胞半定量計數和線索細胞、菌絲/孢子、滴蟲的識別[10];另一張滴加標本的玻片待自然干燥后經革蘭染色在顯微油鏡下(×1 000)的Nugent評分[11]及真菌菌絲/孢子的確認,2種鏡檢方式各由1名有經驗的檢驗技師雙盲完成并記錄結果。

1.3.2復檢規則的篩選參數 針對細菌性陰道病(BV)、外陰陰道假絲酵母菌病(VVC)、滴蟲性陰道炎(TV)三類疾病的篩查確立復檢規則,將BV、VVC、TV疾病診斷具有對應關系的有形成分項目(線索細胞、真菌、滴蟲)和干化學項目里唾液酸苷酶(SNA)、脯氨酸氨基肽酶(PIP)、N-乙酰氨基己糖苷酶(NAG)共6個檢測項作為篩選參數。各檢測項目以超出參考區間數值為陽性,檢測項目與篩查疾病的對應關系[12]及參考區間見表1。

表1 GMD-S600檢測項目與篩查疾病的對應關系及參考區間

雖然酸堿度pH的高低是區分VVC(pH≤4.6)、TV(pH≥4.8)的附加條件,但是由于pH測試的特異性不高[10],且容易受到宮頸黏液、精液、血液或預濕拭子等因素的影響[13-14]而導致錯誤提示,所以不將其列入篩選參數。

1.3.3參考方法 依據國內外指南推薦的對BV、VVC、TV實驗室診斷方法,筆者將濕片鏡檢聯合革蘭染色鏡檢(簡稱聯合鏡檢)結果作為疾病判斷的最終依據。BV陽性以革蘭染色Nugent評分≥7分為最終判斷標準[9,15];真菌菌絲/孢子判斷標準為濕片鏡檢或革蘭染色鏡檢任一方法檢出即可判定[15-16];滴蟲以濕片鏡檢陽性為標準,但當濕片鏡檢活動度減弱疑似不確定時需補充核酸擴增技術進行確認,并以核酸結果為準[13,15];白細胞計數結果取濕片在高倍鏡下10個視野的均值[9]。

1.3.4觸發復檢規則后的復檢程序

1.3.4.1儀器圖譜審核程序 啟用復檢規則后,當有檢測項目觸發規則則首先進入儀器圖譜審核程序。(1)儀器單獨有形成分圖譜陽性警示或有形成分圖譜與對應的干化學項目同時報陽提示時,點入工作站陽性圖譜分類欄確認陽性成分形態是否典型可辨,如典型陽性形態則審核通過為陽性,錯誤識別者判為陰性;若圖譜陽性成分形態不典型或圖像對焦不清晰難以辨別,則進入顯微鏡復檢程序。(2)儀器有形成分陰性但干化學項目陽性報警時,點入工作站圖譜“未分類、上皮細胞、白細胞”等分類觀察是否會有未被識別的陽性成分,如有典型的分類錯誤或未識別的陽性成分則可修正結果為陽性,若未發現相應陽性成分則判為陰性。

1.3.4.2顯微鏡復檢程序 BV項顯微鏡復檢程序:濕片高倍鏡檢有典型的線索細胞或大(多)量的雜菌成團聚集(革蘭染色可見Nugent評分≥7分的細菌成團聚集的特征,簡稱為BV相關細菌團),可以直接判斷為BV陽性;若濕片高倍鏡檢不典型或難以辨別的線索細胞則需要革蘭染色Nugengt評分最終確認。

VVC、TV項顯微鏡復檢程序:濕片鏡檢有典型的真菌菌絲/孢子、滴蟲者,可直接判斷為VVC陽性、TV陽性;未觀察到者為陰性。

1.3.5復檢規則的篩選方法

1.3.5.1初篩規則的方法 將線索細胞、真菌、滴蟲、SNA、PIP、NAG 6個檢測項目利用陰性、陽性兩種檢測結果交叉復檢原則進行排列組合后得到64條篩選條件;使用Excel2013將每家醫院儀器檢測結果導出,統計觸發64條篩選條件的數量;以聯合鏡檢結果為金標準,統計每條篩選條件中儀器結果的假陰性率和假陽性率。

參考《CNAS-CL02-A001:2021醫學實驗室質量和能力認可準則的應用要求》中對尿液、血液結果假陰性率≤5%的要求[17]和中華醫學會檢驗醫學分會血液學與體液學學組《陰道分泌物自動化檢測與報告專家共識》中對陰道分泌物有形成分復檢程序結果假陰性率≤5%的建議[18],以及參考文獻[19],在64條篩選條件中剔除檢測項全部陰性的條件、剔除出現概率為0的條件、剔除假陰性率和(或)假陽性率≤5%的條件,初步形成復檢規則。

1.3.5.2初篩規則啟用后評估 啟用初篩出的復檢規則對儀器結果進行分析。將觸發規則的結果按照復檢程序進行人工干預(先進行儀器圖譜審核,圖譜辨析不明確的再進入顯微鏡復檢程序)。以聯合鏡檢結果為金標準,對復檢后結果進行靈敏度、特異度、符合率、假陰性率、假陽性率等評估指標的分析[7],必要時做規則的調整以符合質量要求。

1.3.6復檢規則驗證方法 檢測隨機臨床標本,評估啟用復檢規則后結果的真陽性率、假陽性率、真陰性率、假陰性率、總符合率、人工干預率及鏡檢復查率。真陽性率=觸發了復檢規則且鏡檢結果陽性標本數/總標本數×100%,假陽性率=觸發了復檢規則而鏡檢結果陰性標本數/總標本數×100%,真陰性率=未觸發復檢規則且鏡檢結果陰性標本數/總標本數×100%,假陰性率=未觸發復檢規則而鏡檢結果陽性標本數量/總標本數×100%,總符合率=(真陽性數量+真陰性數量)/總標本數×100%,人工干預率=(人工審核儀器圖譜數量+顯微鏡鏡檢數量)/標本總數×100%,鏡檢復查率=啟用顯微鏡鏡檢的標本數量/總標本數×100%。

1.3.7儀器與濕片鏡檢白細胞等級偏差分析 將儀器與人工濕片鏡檢白細胞計數結果(/HPF)分為0～<5、5～<15、15～<30、≥30共4個等級,計數不同等級下儀器與人工鏡檢結果的一致性。通過Bland-Altman偏差圖觀察儀器與人工鏡檢結果之間的差異。

1.4統計學處理 應用SPSS22.0軟件分析,計數資料以百分率表示。兩種檢驗方法結果比較采用配對四格表資料的χ2檢驗,以P<0.05為差異有統計學意義。使用Bland-Altman偏差圖,分析儀器白細胞計數與人工計數的差異,Kappa檢驗評價兩種計數方法的一致性。

2 結 果

2.1規則建立標本的聯合鏡檢結果 將聯合鏡檢結果出現線索細胞/Nugent評分≥7分、真菌菌絲/孢子、滴蟲的標本稱為陽性標本,而鏡檢未見異常者稱為陰性標本。用于建立復檢規則的3 407份標本中BV陽性370份(10.86%),VVC陽性592份(17.38%),TV陽性44份(1.29%),BV+VVC混合感染85份(2.49%),BV+TV混合感染8份(0.23%),總體陽性標本率為26.74%,基本符合日常陰道分泌物檢測中三類疾病的陽性檢出率[20-21]。

2.2復檢規則的篩選結果

2.2.1初篩結果 以聯合鏡檢結果為金標準,對64條組合項的儀器檢測結果逐一分析,篩選出38條需要復檢的規則和26條無需復檢的規則;其中,觸發概率≥2%的規則編號依次為7號、3號、16號、21號、37號、40號和5號。38條復檢規則見表2。

表2 GMD-S600全自動陰道分泌物分析系統38條復檢規則

2.2.2初篩規則啟用后評估結果 啟用38條復檢規則對3 407份儀器檢測結果進行分析,觸發規則的標本2 182份,顯微鏡鏡檢復檢率為9.95%(339/3 407),BV、VVC、TV的假陽性率和TV的假陰性率得到了良好的控制,均<5%,但是BV和VVC的假陰性率分別為5.99%(204/3 407)、5.37%(183/3 407),需要進一步分析原因進行規則的調整。

2.2.3復檢規則的分析及調整 對觸發了規則但復檢后仍出現156份BV和153份VVC漏檢的標本分析后發現,38條復檢規則已經涵蓋了這些標本的報警提示,所以無需再增加規則。統計38條規則里有效陽性警示率超過50%的有20條,基本集中在有形成分和干化學項目參數同時陽性或有形成分陰性但多個干化學參數報陽警示的規則里。然而,對于這些規則筆者啟用的顯微鏡復檢比例較低,未能及時糾正圖譜審核時假陰性的誤判。為防止漏檢且同時考慮顯微鏡復檢率可控的前提下,筆者以這20條為基礎再增加規則編號10“有形線索細胞+,干化學SNA+”及規則編號21“有形成分陰性,干化學SNA+、NAG+”共22條,增加其執行“當圖譜審核無典型陽性有形成分發現時,需要強制顯微鏡鏡檢最終確認”的條件。其他16條規則依然遵循“先儀器圖譜審核,圖譜辨析不明確時再進入顯微鏡復檢程序”的要求。22條需執行強制鏡檢程序的規則見表3。

表3 22條需執行強制鏡檢條件的規則

2.2.4增加復檢規則條件后分析結果 將22條附加鏡檢條件的規則應用后與聯合鏡檢的結果再次比較分析,BV和VVC的假陰性率得到有效控制,顯微鏡鏡檢復檢率為23.62%(805/3 407)。采用配對χ2檢驗比較BV、VVC、TV的靈敏度在啟用復檢規則前與應用規則及附加鏡檢條件后差異有統計學意義(P<0.001)。結果分析具體見表4。

表4 GMD-S600系統啟用復檢規則前后結果分析

在38條復檢規則和附加鏡檢條件的基礎上,為進一步減少無效的人工干預,筆者將“規則編號7”觸發標本數量多但假陽性率高[85.19%(673/790)]的“單獨干化學NAG+”規則剔除,人工干預率降至為40.86%(1 932/3 407),得到BV、VVC、TV的假陰性率和靈敏度分別為3.40%、68.65%,5.22%、69.98%,以及0.21%、84.44%,顯微鏡鏡檢復檢率23.10%,需再通過驗證分析后判斷是否可行。

2.3復檢規則驗證 連續隨機應用國際和平婦幼保健院和長春市婦幼保健院共748份臨床標本,啟用37條復檢規則及22條附加鏡檢條件進行驗證。驗證結果只觸發了37條復檢規則中的21條和12條附加鏡檢的條件,BV、VVC、TV的假陰性率依然可控,人工干預率44.38%(332/748),其中顯微鏡鏡檢復檢率為22.19%(166/748)。驗證結果達到質量要求,且人工干預率和顯微鏡鏡檢復檢率均可被接受。具體驗證數據分析見表5。

表5 GMD-S600系統啟用37條復檢規則及22條附加強制鏡檢條件后驗證結果

2.4白細胞等級一致性分析結果 儀器與人工濕片計數白細胞等級一致的有2 221份,一致率為65.19%,Kappa值=0.536,為中等的一致性。對兩組數據做Bland-Altman偏差分析,在一致性界限外有6個坐標點(編號1～6)共215份,將其中坐標點為(22.5,15)一致性界限外的51份“鏡檢結果≥30,儀器結果15～<30”修正為可接受的一致性,因為只相差一個等級且都為陽性;剩余164份為“陰、陽性不符且相差2個等級”,超出一致性界限外的百分率為4.81%(164/3 407)。見表6、圖1。

圖1 白細胞計數Bland-Altman偏差圖

表6 儀器與人工鏡檢結果之間的差異

3 討 論

陰道微生態評價包括形態學檢測和功能學檢測,是2016年中華醫學會婦產科學分會感染性疾病協作組專家指南推薦的陰道感染診斷方法[22]。依托儀器智能發展的平臺及共識指南的指導,應用于臨床新一代的全自動陰道分泌物分析系統基本都具備形態學檢測和功能學檢測兩大模塊。其中功能學檢查項目及檢測原理基本相同,而濕片有形成分檢測原理主要有基于支持向量機(SVM)細胞圖像識別分類算法[23]和基于深度學習的目標檢測算法[24-25]兩大類。

形態學和功能學的聯合檢測對疾病篩查的靈敏度和符合率優于單獨的干化學或單獨的形態學檢測[26],但鄭大勇[27]和楊尚瑜等[20]將自動化儀器檢測結果與濕片/顯微鏡鏡檢結果相比,認為自動化分析系統不能完全替代人工鏡檢,部分情況還是需要顯微鏡鏡檢最終確認。本研究對GMD-S600分析系統在未啟用復檢規則檢測3 407份標本的結果分析也證實,VVC項目的假陰性率、假陽性率和BV項目的假陰性率均>5%,需要結合顯微鏡鏡檢復查進行質量控制。

由于目前國內少見陰道分泌物自動化檢測系統的顯微鏡復檢方案相關文獻,也缺乏相應的質量文件細則指導,本研究參考了馬駿龍等[19]對尿液有形成分鏡檢篩選的方法,以《CNAS-CL02-A001:2021醫學實驗室質量準則要求》為依據,對GMD-S600分析系統進行復檢規則的篩選。篩選出的38條復檢規則觸發條件基本涵蓋了儀器單獨有形成分陽性、單獨干化學陽性、干化學和有形成分檢測陽性結果相符或不符的情況。

以聯合鏡檢結果為標準分析BV、VVC、TV在38條復檢規則中陽性例數占比較高的,基本集中在有形及干化學篩選參數陽性數多的規則里;其中,最高的VVC陽性率為69.69%(200/287)是規則編號16“有形真菌+,干化學NAG+”;而最高的BV陽性率為73.49%(61/83)是規則編號40“有形線索細胞+,干化學SNA+、NAG+”,其次為規則編號12“有形線索細胞+,干化學NAG+”、規則編號16“有形真菌+,干化學NAG+”等伴有“NAG+”的規則里,其有對應關系的“有形線索細胞+,干化學SNA+”規則中BV陽性數卻不是最有優勢。

分析NAG檢測原理,雖然β-N-乙酰氨基己糖苷酶在真核生物真菌和滴蟲中活性較強[12],但也廣泛存在于細菌、放線菌等原核生物,具有雙重底物特異性水解乙酰氨基葡萄糖或乙酰氨基半乳糖[28]。β-N-乙酰氨基己糖苷酶分屬于GH20、GH3、GH84三大糖苷水解酶家族,其中GH84家族的NAG來源于擬桿菌[28-29],而擬桿菌又是BV相關菌群組成中主要的厭氧菌屬[13],所以當BV陽性擬桿菌豐度增加時可能也會引起NAG陽性的表現。因而當NAG陽性,特別是同時SNA陽性和(或)有形線索細胞陽性時,提示在儀器圖譜審核或鏡檢復查時除了真菌、滴蟲的識別,也要特別留意是否有BV的存在。

唾液酸酶作為BV的一種重要毒力因子主要由陰道加德納菌、普雷沃菌分泌產生,可以作為BV的診斷標志物[9,30],但JANULAITIENE等[5]發現,陰道加德納菌的唾液酸酶活性在不同的基因亞組之間存在顯著性差異分布,使用定量PCR(qPCR)分型加德納分離株進化株4中缺乏編碼唾液酸酶的基因,因而單獨SNA的活性檢測可能會造成BV的漏檢。同樣,單獨的NAG活性檢測也可能因為一些非白假絲酵母菌不產生此酶[12]而造成VVC的漏檢。本研究對規則建立時數據分析也發現單獨干化學SNA+、單獨NAG+和單獨PIP+的有效陽性警示率都較低,分別為23.61%(17/72)、16.33%(129/790)和0.00%(0/7)。以上現象說明獨立的干化學酶反應特性可能會存在局限性、交叉性及易受干擾性。然而,當這三類干化學項目聯合陽性或與有形成分聯合陽性時它們的有效陽性警示效應卻大為提升。

不同于尿液細胞定量計數篩查的要求,陰道分泌物BV、VVC、TV的診斷是相關病原菌(體)的定性篩查,2016年中華醫學會婦產科學分會感染性疾病協作組專家共識明確指出,當形態學檢測與功能學檢測結果不一致時,以形態學檢測為主要參考指標[22]。本課題組認為,為了剔除干擾因素的影響,即使有形與干化學對應相符的陽性提示還是需要人工儀器圖譜的審核確認,但由此可能會導致人工干預率偏高。GMD-S600有形成分分析是一種基于SVM的細胞分類識別技術,該技術已廣泛應用于腫瘤細胞診斷、尿液細胞分類等醫學細胞圖像分類領域[23,31]。在本實驗復檢規則驗證階段,觸發規則的332份標本中有一半是可以通過儀器圖譜審核判別,所以顯微圖像的正確識別可以大大減少人工顯微鏡鏡檢的啟用,王萍等[32]的研究中也有同樣的體現。

然而,不管是基于何種算法的圖像識別技術,對于復雜高維特性的臨床采集圖像都需要持續訓練和更新優化算法,解決類似于雜菌黏附遮蓋的線索細胞成像模糊、脫落于陰道上皮細胞形成致密生物膜的BV相關細菌團[33]被錯分類為白細胞、黏附于上皮的菌絲孢子未被識別及彎曲的長桿菌被錯分類為菌絲等現象。因此在儀器自動化發展進程中除卻智能化圖像識別帶來的便利和效率外還是需要顯微鏡鏡檢金標準方法進行補充,特別是革蘭染色顯微鏡鏡檢結果對BV的最終確認。所以在筆者的復檢規則中強調了22條附加鏡檢條件,進一步控制漏檢率。

陰道分泌物中白細胞的炎癥表現并不與BV、VVC有絕對關聯,但是白細胞的半定量計數還是能比較直觀反映陰道炎癥狀況,是需氧菌性陰道炎判別的重要條件。GMD-S600計數白細胞與人工濕片計數白細胞等級分析完全一致的有65.19%,儀器與人工計數有差異但“陰陽不符且相差2個等級”超出一致性界限外的百分率可控在5%以內,提示儀器白細胞半定量結果基本可信。分析造成一致性差異的常見原因:人工鏡檢制片時因標本黏液型導致局部細胞聚集,基底層小圓上皮細胞、滴蟲體型偏小以及BV相關細菌團都有可能被儀器誤判為白細胞。所以當儀器計數結果與干化學白細胞脂酶陰陽不符且相差2個等級時需要濕片顯微鏡鏡檢進一步確認。

經規則驗證后證實,綜上分析的陰道分泌物干化學酶和有形成分檢測中存在的局限性和干擾性,基本可以在建立的37條復檢規則及22條附加鏡檢條件的干預下得到有效的控制,后繼可以通過儀器軟件的編制將復檢規則及其附加條件添加至系統工作站進行自動化審核應用,各地方實驗室可結合實際使用情況對相關規則進行周期性驗證調整,使之能更好地服務于自動化檢測系統的質量管理。