漿母細胞在成人原發免疫性血小板減少癥中的表達特征及臨床價值*

方佩琪,朱 捷,顧梅秀,王蓓麗△,潘柏申,郭 瑋,2,3,4

1.復旦大學附屬中山醫院檢驗科,上海 200032;2.上海市老年醫學中心檢驗科,上海 201100;3.上海市寶山區吳淞中心醫院檢驗科,上海 201900;4.復旦大學附屬中山醫院廈門醫院檢驗科,福建廈門 361015

原發免疫性血小板減少癥(ITP)是一種以孤立性血小板減少為特征的獲得性自身免疫性出血性疾病,多以自身免疫所介導的抑制血小板生成并加快血小板破壞為表現的血液系統疾病,據文獻報道其在臨床出血性疾病中約占30%[1]。ITP的發病機制是血小板自身抗原免疫耐受性丟失,導致體液和細胞免疫異常活化,共同介導血小板破壞加速及巨核細胞產生血小板不足所致[2]。目前臨床已知的血小板自身抗體包括GPⅡb/Ⅲa和抗GPⅠb/Ⅸ抗體等[3]。而成人患者B淋巴細胞亞群的分化狀態在ITP發病過程中也起著重要作用。B淋巴細胞是一種在適應性免疫反應中起關鍵作用的細胞,其通過產生抗體發揮特異性體液免疫作用[4-5],可生成高親和力抗體、生成免疫細胞及充當抗原呈遞細胞,并分泌細胞因子。本研究擬通過分析成人ITP與成人繼發性血小板減少患者外周血中B淋巴細胞亞群的變化,探索成人ITP的發病機制,以期為臨床鑒別診斷、監測及治療ITP提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2022年7—12月來復旦大學附屬中山醫院就診的20例ITP患者和20例繼發其他各種疾病導致的血小板減少患者(非ITP血小板減少患者)分別作為ITP組和非ITP血小板減少組。納入標準:(1)ITP患者的臨床診斷符合《成人原發免疫性血小板減少癥診斷與治療中國指南(2020年版)》中相關要求,初診為ITP,血小板計數減少且外周血鏡檢血常規形態無明顯異常,骨髓檢查為巨核細胞增多或正常,排除其他繼發血小板減少癥,未接受臨床治療。(2)非ITP血小板減少患者為由于各種病理疾病和生理原因導致的血小板下降者。另選取同期24例體檢健康者作為健康對照組。本研究通過復旦大學附屬中山醫院倫理委員會審批(倫理審批號為B2022-348),符合赫爾辛基宣言。所有研究對象對本研究內容知情并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 美國BD公司PerCP-Cy5.5標記的小鼠抗人CD45單克隆抗體(貨號:663499);西班牙Cytognos公司FITC標記的小鼠抗人CD38單克隆抗體(貨號:CYT-38F);美國Beckman Coulter公司PC7標記的小鼠抗人CD19單克隆抗體(貨號:IM3628);美國Biolegend公司BV510標記的小鼠抗人CD27單克隆抗體(貨號:302835)。FACS CantoⅡ流式細胞儀及溶血素FACS Lysing Solution(貨號:349202)購自美國BD公司。

1.3方法 100 μL新鮮外周血中加入5 μL PerCP-Cy5.5標記CD45抗體、5 μL FITC標記CD38抗體、5 μL BV510標記的CD27抗體、5 μL PC7標記CD19抗體,避光孵育 15 min。然后,加入1 000 μL 的溶血素,避光孵育 10 min。250×g 離心5 min,棄上清液,再加2 000 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)振蕩混勻后再次離心5 min,棄上清液,加入500 μL PBS重懸細胞,制成所需的單細胞懸液后上機檢測。使用BD公司的Diva流式分析軟件獲取數據并進行分析。收集細胞使用中速,收集50 000個白細胞,在CD45/SSC散點圖上設門,圈選出淋巴細胞;在淋巴細胞門下以CD19/SSC散點圖上圈選CD19+為B淋巴細胞群;然后,在CD38/CD27散點圖上分析CD19+B淋巴細胞中各個亞群的分布情況。

2 結 果

2.1一般資料比較 ITP組、非ITP血小板減少組、健康對照組性別、年齡比較,差異均無統計學意義(P>0.05)。與健康對照組比較,ITP組、非ITP血小板減少組血小板計數顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05);ITP組漿母細胞占CD19+細胞比例顯著上升,非ITP血小板減少組初始B細胞占CD19+細胞比例顯著上升、記憶B細胞占CD19+細胞比例顯著下降,差異有統計學意義(P<0.05),其余淋巴細胞亞群指標比較,差異無統計學意義(P>0.05);與非ITP組血小板減少組比較,ITP組漿母細胞、記憶B細胞各占CD19+細胞比例均上升,初始B細胞占CD19+細胞比例下降,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 ITP組、非ITP血小板減少組和健康對照組漿母細胞、初始B細胞及記憶B細胞及臨床參數比較或n/n或M(P25,P75)]

2.2流式細胞術結果比較 收集細胞以CD19/SSC設門,ITP組、非ITP血小板減少組及健康對照組B淋巴細胞亞群表面抗原表達為:漿母細胞(CD19+CD27++CD38++)、初始B細胞(CD19+CD27-CD38-)和記憶B細胞(CD19+CD27+CD38-)。見圖1。

注:A為ITP組;B為非ITP血小板減少組;C為健康對照組。

2.3漿母細胞與ITP發生的相關性 以年齡、性別、血小板、漿母細胞比例為因變量,分析ITP發生的危險因素。Logistic回歸分析顯示,漿母細胞比例是ITP發生的危險因素(P<0.01)。當模型未校準時,OR=3.31(P<0.01),校準年齡、性別后,ITP的發生風險增加2.65倍,OR=3.65,95%CI為1.74～7.68(P<0.01);進一步校準年齡、性別和血小板計數后,ITP的發生風險增加3.78倍,OR=4.78,95%CI為1.58～14.49(P<0.01)。隨著漿母細胞比例升高,發生ITP風險增加。見圖2。

圖2 漿母細胞比例與ITP發生風險的量效關系

3 討 論

ITP是一種獲得性自身免疫性出血性疾病,以無明確誘因的孤立性外周血血小板計數減少為主要特點[6],而國內目前尚無基于人口基數的ITP流行病學調查統計。國外相關文獻報道的成人ITP發病率波動范圍為(2～10)/10萬,其中兒童及60歲以上人群高發[7-9]。目前普遍認為血小板自身抗原免疫耐受性缺失,導致體液(抗血小板抗體)、細胞(T細胞)免疫異常活化,共同介導了血小板破壞及單核巨核系統受損,從而導致外周血血小板減少[10-11]。因此,B細胞發育失調也與ITP的發生有關,其通過產生自身抗體加速血小板的破壞,并黏附于巨核細胞表面,進而影響巨核細胞的成熟,導致ITP的發生[12]。外周血中的漿母細胞是由活化后的B細胞逐步分化形成的,轉入淋巴結組織的部分漿母細胞形成短壽漿細胞,另一部分遷移入骨髓或炎癥組織形成長壽漿細胞[13]。長壽漿細胞會持續分泌自身免疫抗體,同時在漿細胞樣樹突細胞的共同參與下激活B細胞,再次分化為漿母細胞,進而形成短壽漿細胞,分泌自身免疫抗體,引起疾病復發。衰老的長壽漿細胞在這一機制過程中還會被新生的漿細胞替換,導致漿母細胞比例持續維持在較高的水平[14]。這表明外周血漿母細胞比例的增高是不同自身免疫性疾病的典型表現[15-16]。

本研究結果發現,與非ITP血小板減少組和健康對照組相比,ITP組外周血漿母細胞比例顯著增高,提示漿母細胞在ITP發病機制中發揮了相應作用。紀宗斐等[17]研究顯示,IgG4-RD患者體內的B細胞大量地活化并轉化為漿細胞,導致CD19lowCD38+CD20-CD27+循環漿母細胞數量顯著升高。本研究通過Logistic回歸分析了患者的年齡、性別、血小板和漿母細胞比例等混雜因素與ITP發生風險存在的量效關系,結果顯示,漿母細胞是量效關系中的危險因素,可作為獨立的風險預測因素。

值得注意的是,FLINT等[18]研究發現,B細胞成熟抗原(BCMA)在ITP患者的漿母細胞上持續高表達,因此推測其可能是ITP患者漿母細胞靶向治療的靶點。然而,LEE等[19]研究認為,B細胞清除療法(抗體藥物靶向結合B細胞特異性抗原)是治療自身免疫性疾病的可能策略。本研究中納入的ITP患者均是初診患者,在未接受免疫或激素治療前僅漿母細胞比例高于非ITP血小板減少組,在后續研究中將進一步關注不同治療方案、疾病進程等因素對漿母細胞比例、血小板計數變化的影響。

漿母細胞作為漿細胞的前體,既可大量分泌自身免疫抗體,直接參與自身免疫性疾病進程,又可分化為長壽漿細胞,對疾病造成長遠的影響。同時,這些存在于外周血中的漿母細胞也便于在臨床開展流式細胞術檢測,輔助診斷ITP,為臨床提供更多元化的診斷路徑。因此,在各類自身免疫性疾病中,監測外周血漿母細胞比例具有重要的臨床意義。

本研究仍然存在不足,如缺少對ITP發病機制的深入研究,沒有更細化分析ITP患者的疾病階段。本課題組將繼續探討漿母細胞在ITP發生發展中的機制,并且希望能通過更多的病例來探索不同方法治療后ITP患者體內漿母細胞比例的變化。