紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定贛南風(fēng)車(chē)子中總黃酮的含量

胡宏凱，彭金年，黃 純，賴偉杭，張夢(mèng)雅，程庚金生*

（1.贛南醫(yī)科大學(xué)，江西贛州 341000；2.贛州市立醫(yī)院，江西贛州 341000）

風(fēng)車(chē)子（Combretum alfrediihance）為使君子科風(fēng)車(chē)子屬植物，別名水番桃、清涼樹(shù)、華風(fēng)車(chē)子、四角風(fēng)，分布于江西、湖南、廣東、廣西等地[1]。風(fēng)車(chē)子屬植物的根、莖、葉、花和種子均可入藥，在不同地區(qū)被當(dāng)作民間藥廣泛用于治療肝炎、痢疾、呼吸道感染甚至癌癥[2,4]。現(xiàn)代藥理研究表明該屬植物具有保肝、抗炎、殺菌、抗癌和抗艾滋病等作用[2,4]，其化學(xué)成分主要以二苯乙烯類(lèi)、三萜化合物及菲類(lèi)化合物為主，此外還有大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、黃酮類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、生物堿類(lèi)和甾體類(lèi)化合物等[2-7]。

黃酮類(lèi)成分可能是風(fēng)車(chē)子屬植物的主要藥效成分之一，但目前對(duì)風(fēng)車(chē)子黃酮類(lèi)化合物的研究相對(duì)較少，本論文擬用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定風(fēng)車(chē)子中總黃酮的含量，建立風(fēng)車(chē)子總黃酮含量比色測(cè)定的方法，為風(fēng)車(chē)子的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（WK-1000A，上海新諾儀器設(shè)備有限公司），十萬(wàn)分之一電子天平（AB135-S，瑞士梅特勒有限公司），數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司），紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV2600，島津儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1001，上海愛(ài)郞儀器有限公司），超純水系統(tǒng)（Direct-Q 5，默克密理博有限公司）。

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080-201610），超純水（自制），乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等試劑均為分析純。風(fēng)車(chē)子（市售）經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院彭金年副教授鑒定為使君子科風(fēng)車(chē)子屬植物風(fēng)車(chē)子（Combretum alfredii hance）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取105 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品20 mg，用60 %乙醇溶解定容至100 mL，配制成0.2 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

將風(fēng)車(chē)子60 ℃烘干，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目藥篩。精密稱取1.000 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入60%乙醇后，置于超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行提取（料液比1:34，提取時(shí)間60分鐘[8-9]），抽濾，濾渣同法再提取2次，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至適量，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，以60%的乙醇定容至刻度，得風(fēng)車(chē)子供試品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分別置于50 mL容量瓶中，各加60%乙醇溶液至12 mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液2 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液2 mL，搖勻后放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液20 mL，搖勻后放置5 min，加60%乙醇溶液至刻度，搖勻后放置15 min。

測(cè)量波長(zhǎng)的確定：以未加蘆丁對(duì)照品溶液的第1瓶溶液作空白，對(duì)加入8.0 mL蘆丁對(duì)照品溶液的第5瓶溶液在350～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，得蘆丁對(duì)照品顯色后的吸收曲線；同法對(duì)風(fēng)車(chē)子供試品溶液適量顯色處理后掃描，得到風(fēng)車(chē)子樣品顯色后的吸收曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1。對(duì)比蘆丁對(duì)照品和風(fēng)車(chē)子樣品的吸收曲線，選擇508 nm為定量測(cè)量波長(zhǎng)[9]。

圖1 蘆丁對(duì)照品和風(fēng)車(chē)子樣品顯色后的吸收曲線Fig.1 Absorption spectrum of rutin standard and Gannan Combretum alfredii samples after color development

以未加蘆丁對(duì)照品溶液的第1瓶溶液作空白，在定量波長(zhǎng)508 nm處測(cè)定各溶液的吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性擬合得回歸方程y=8.652x-8.524E-4（R2=0.9986），線性范圍0.008～0.040 mg/mL，見(jiàn)圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Rutin standard curve

2.4 風(fēng)車(chē)子總黃酮含量測(cè)定

取2.2項(xiàng)下風(fēng)車(chē)子供試品溶液0.5 mL，置于50 mL容量瓶中，依2.3項(xiàng)下方法依次加入顯色劑，在508 nm測(cè)定其吸光度，重復(fù)測(cè)定3次，以吸光度平均值根據(jù)回歸方程計(jì)算風(fēng)車(chē)子黃酮含量。

計(jì)算得贛南風(fēng)車(chē)子樣品總黃酮含量為（58.42±0.19）mg/g(n=3)。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn)

取蘆丁對(duì)照品溶液5 mL，置于50 mL容量瓶中，依2.3項(xiàng)下方法分別加入顯色劑后測(cè)定其吸光度，反復(fù)測(cè)定6次，以吸光度值計(jì)算，RSD為1.01%，表明精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別取蘆丁對(duì)照品溶液5 mL和風(fēng)車(chē)子供試品溶液2 mL，置于50 mL容量瓶中，依2.3項(xiàng)下方法分別加入顯色劑后，依法分別于0、20、40、60、80、100、120 min測(cè)定，以吸光度值計(jì)算，RSD為分別為0.86%和1.98%，表明該測(cè)定方法2 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

精確稱量風(fēng)車(chē)子粉末6份，按2.2項(xiàng)下方法制備風(fēng)車(chē)子供試液，依2.3項(xiàng)下方法分別加入顯色劑后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，以吸光度值計(jì)算，RSD（n=6）為2.28%，表明該法具有良好的重現(xiàn)性。

2.5.4 加樣回收率試驗(yàn)

取已測(cè)總黃酮濃度的樣品溶液適量，平行進(jìn)行6份試驗(yàn)，加入蘆丁對(duì)照品適量，依2.3項(xiàng)下方法分別加入顯色劑后測(cè)定其吸光度，根據(jù)回歸方程、加樣回收率計(jì)算公式，得平均加樣回收率為97.74%，RSD為1.84%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論與討論

風(fēng)車(chē)子中黃酮類(lèi)化合物經(jīng)超聲提取、硝酸鋁顯色后，可用紫外-可見(jiàn)分光光度法在508 nm下定量測(cè)定。線性擬合得回歸方程y=8.652x-8.524E-4（R2=0.9986），線性范圍0.008～0.040 mg/mL，測(cè)得贛南風(fēng)車(chē)子中黃酮含量為（58.42±0.19）mg/g(n=3)，該方法操作簡(jiǎn)便、快捷、高效、結(jié)果準(zhǔn)確、精密度和穩(wěn)定性好，雜質(zhì)干擾少。風(fēng)車(chē)子是江西贛南地區(qū)的特色中藥材之一，開(kāi)發(fā)利用風(fēng)車(chē)子對(duì)促進(jìn)贛南特色中藥材發(fā)展具有一定的意義，本文建立了超聲提取、紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定風(fēng)車(chē)子總黃酮含量的測(cè)定方法，可為開(kāi)發(fā)利用贛南風(fēng)車(chē)子總黃酮提供定量分析方法。