外周血Septin9 基因甲基化檢測在結直腸腺瘤中的預測價值

鄧菊慶，于 璐，廖麗瓊，楊忠存

（昆明市第一人民醫院病理科，云南 昆明 650011）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）目前是消化道最常見的惡性腫瘤，在2020 年世界癌癥報告數據中顯示，新發的結直腸癌病例數位居第二，死亡人數位居第五[1]。在我國，大部分結直腸癌確診時多為中晚期，5 a 生存率不足50%。因此，結直腸癌早期診斷率的提高顯得尤為重要。結直腸癌的主要發生途徑為腺瘤癌變途徑，傳統腺瘤癌變途徑導致70%～90%的結直腸癌，鋸齒狀新生物導致10%～20%的結直腸癌[2]。目前主要篩查方法為腸鏡、血清癌胚抗原檢測、糞便潛血實驗及近年來逐步開展使用的mSEPT9 檢測、多靶點糞便FIT-DNA 檢測等。上述方法各有優勢及不足，特別是對于結直腸癌發生的早期病變-結直腸腺瘤的檢測敏感性及特異性差異較大。而結直腸癌的發生途徑主要為腺瘤癌變而來，因此，如能通過提高對結直腸腺瘤早期診斷率從而進行無創-有創的分層遞進檢查，不僅結直腸癌的早期診斷率能顯著提高，也易于在健康人群中進行推廣篩查，從而可以顯著提高結直腸癌篩查的可操作性。筆者通過對結直腸腺瘤實驗組（包括低、高級別上皮內瘤變）和對照組（腸鏡檢查陰性）外周血mSEPT9 檢測結果分析并探討其在結直腸腺瘤發生中的預測意義，并將其與外周血CEA 結果進行對比，以期獲得結直腸腺瘤早期診斷中最優化的篩查方案，并對是否進行侵入性腸鏡做一定程度的分流作用，減少患者因行侵入性腸鏡檢查并發癥風險及增加結直腸腺瘤篩查的可操作性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年10 月至2022 年5 月期間在昆明市第一人民醫院病理科行結腸鏡檢查鏡下取材送檢診斷為大腸腺瘤的30 名患者作為實驗組研究對象，將22 例腸鏡檢查結果陰性受試者作為對照組研究對象。該研究中受試者均簽署知情同意書，并經本院醫學倫理委員會審查批準通過，倫理批件號：YLS-53。

1.1.1 納入標準（1）實驗組：受試者均經腸鏡及組織活檢病理診斷，依據診斷標準[3]確診為結直腸腺瘤，含25 例低級別腺瘤（包含管狀腺瘤伴低級別上皮內瘤變、絨毛狀-管狀腺瘤伴低級別上皮內瘤變；5 例高級別腺瘤（包含絨毛狀-管狀腺瘤伴高級上皮內瘤變、管狀腺瘤伴高級別上皮內瘤變、鋸齒狀腺瘤伴高級別上皮內瘤變）；（2）對照組：經結直腸鏡檢測無結直腸腺瘤受試者。

1.1.2 排除標準（1）受試者存在全身感染性疾病、精神疾病，以及其他嚴重器質性病變；（2）女性受試者處于妊娠狀態；（3）受試者年齡大于75 歲。

1.1.3 觀測指標：實驗組及對照組受試者均檢測有外周血外周血mSEPT9 及CEA 血清濃度。

1.2 研究方法

本檢測是運用實時熒光定量PCR 平臺，采用甲基化特異性引物和Taqman 特異性熒光檢測技術，偏向擴增和檢測甲基化片段。利用重亞硫酸鹽處理DNA 可將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶，而甲基化特異性引物特異識別甲基化片段，并偏向擴增甲基化模板，利用Taqman 探針特異性識別甲基化片段，以鑒別甲基化片段的存在。另外通過Blocker 與非甲基化片段的結合，抑制高濃度野生型DNA 可能存在的翹尾現象。本試劑盒選擇Sep 和內參基因ACTB 同時擴增的雙重PCR 受控體系，通過陽性質控品和陰性質控品與樣本平行提取、硫化純化、PCR 檢測，可對樣本的檢測過程進行質控。

標準化操作規程：（1）含EDTA 抗凝劑的采血管進行采血5 mL、溫度為2～8 ℃保存；（2）血漿游離DNA 提取：采用磁珠法進行血漿游離DNA的提取；①DNA 硫化修飾和純化：采用硫化試劑進行血漿游離DNA 的硫化修飾后，利用純化試劑對硫化后的產物進行純化，作為mSEPT9 檢測的模板；②血漿樣品中SEP9 甲基化檢測（熒光PCR 法）；③分析PCR 結果：FAM CP ≤ 47.93，有擴增信號，且呈 S 型擴增曲線趨勢，并且 VIC CP≤40.21 則結果為陽性；FAM CP >47.93，并且VIC CP≤40.21 則結果為陰性。

1.3 統計學處理

采用SPSS 26.0 及GraphPad Prism 9 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示。使用受試者特征曲線（ROC）進行外周血mSEPT9檢測結果及外周血CEA 結果對特異性及敏感性進行統計分析，采用Fisher 精確檢驗對mSEPT9 結果與腺瘤級別進行統計分析，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 受試者基本信息

實驗組（腺瘤組30 例）：（1）低級別腺瘤組25 例：絨毛狀-管狀腺瘤伴低級別上皮內瘤變7 例，男性6 例，其中mSEPT9 陽性5 例，平均年齡（51.80±13.85）歲；陰性1 例：69 歲；女性1 例：mSEPT9 陰性；管狀腺瘤伴低級別上皮內瘤變18 例：男性9 例，其中mSEPT9 陽性4 例，平均年齡（53.00±5.35）歲；陰性5 例：平均年齡（50.80±22.65）歲；女性9 例：其中mSEPT9 陽性7 例，平均年齡（59.43±10.75）歲；陰性2 例，平均年齡（66.50±6.36）歲。（2）高級別腺瘤組：5 例：絨毛狀-管狀腺瘤伴高級別上皮內瘤變2 例：男性1 例，mSEPT9 陰 性，72 歲；女 性1 例，mSEPT9 陽性，49 歲，管狀腺瘤伴高級別上皮內瘤變2 人：男性1 例mSEPT9 陰性，67 歲；其中，女性，1 例，mSEPT9 陽性，73 歲；鋸齒狀腺瘤伴高級別上皮內瘤變，女性1 例，mSEPT9 陽性，49 歲。對照組：男性7 例，女性15 例，平均年齡（47.77±12.01）歲。

2.2 CEA 血清濃度

實驗組2 例大于3.4 ng/mL，分別為5.44及8.88 ng/mL；對照組：CEA 血清濃度均小于3.4 ng/mL。

2.3 結直腸低、高級別腺瘤的病理形態

低級別管狀腺瘤及絨毛狀管狀腺瘤共計25 例，高級別絨毛管狀及鋸齒狀腺瘤共計5 例，其病理形態見圖1：低級別管狀腺瘤：見增生的腺管，腺上皮細胞核柱狀，排列緊密；低級別絨毛狀管狀腺瘤：見增生的腺體，呈乳頭狀及腺管狀，腺上皮細胞核柱狀，排列緊密；高級別絨毛狀腺瘤：見增生的乳頭狀結構，腺體上皮細胞核卵圓形、圓形，有異型，核分裂像可見；鋸齒狀腺瘤：見增生的腺體呈鋸齒狀，腺上皮細胞核圓形、卵圓形，有異型，可見核分裂。對照組為腸鏡陰性門診患者，因此無病理形態圖。圖1 所顯示的病理形態圖是本次研究實驗組入組對象的病理形態圖，代表了入實驗組研究對象的主要鏡下結構。

圖1 結直腸低、高級別腺瘤的HE 病理形態（×20）Fig.1 Pathological morphology of colorectal low-and high-grade adenoma by HE staining（×20）

2.4 外周血mSEPT9 檢測比CEA 檢測有更高的敏感度、特異度的預測價值

外周血mSEPT9 檢測，受試者特征曲線顯示：曲線下面積為0.720 5，P=0.007 0，差異具有統計學意義，利用約登指數計算其分界值（Cut-off 值）即CT 值是39.55，對應的敏感度為90.91%，特異度為56.67%；外周血CEA 血清濃度檢測受試者特征曲線顯示：曲線下面積為0.533，P=0.683 7，見圖2。

圖2 外周血mSEPT9 檢測結果與CEA 血清濃度的ROC 曲線比較Fig.2 The ROC comparison between the detection of mSEPT9 and CEA in peripheral blood

2.5 低、高級別腺瘤組mSEPT9 檢測結果

在本研究中腺瘤高級別受試者有5 例，陽性3 例，陰性2 例，陽性率60%，腺瘤低級別受試者有25 例，陽性17 例，陰性8 例，陽性率68.00%，將2 組腺瘤對應的mSEPT9 陽性例數進行Fisher 精確檢驗（P>0.05），見圖3。

圖3 低、高級別腺瘤組mSEPT9 陽性數的比較Fig.3 Comparison of mSEPT9 positivity in the low-and high-grade adenoma groups

3 討論

Septin 是一類具有鳥苷三磷酸活性的保守基因家族，廣泛存在于生物中，其中Septin9 基因是Septin 基因家族的一員，位于人類染色體17q25.3，是一種細胞周期相關蛋白，參與許多生物過程，如細胞分裂、胞膜重建、極化、囊泡運輸、脫氧核糖核酸修復、細胞遷移及凋亡[4]，與人類很多疾病尤其是腫瘤相關，在其發生發展中發揮重要作用。目前，已有多項研究通過檢測受檢者外周血游離Septin9 異常甲基化發生情況，從而判斷受檢者患結直腸癌的可能性，但其作為預測早期結直腸癌報道的敏感性及特異性卻各不相同[5-7]。

3.1 SEP9 基因甲基化在結直腸腺瘤中的敏感性及特異性

WARREN JD、CHURCH TR 等[8-9]研究顯示，血漿mSEPT9 在結直腸腺瘤/息肉組中的陽性檢出率（11.5% 和 11.2%）與對照組（10.0% 和 9.1%）相比，（P>0.05），提示血漿mSEPT9 及血清 CEA對結直腸良性腫瘤（如腺瘤與息肉）的檢出率不高，這與筆者的研究結果不一致。本研究顯示外周血mSEPT9 檢測顯示ROC 曲線下面積為0.720 5，P值為0.007 0（P<0.05），差異具有統計學意義。敏感度為90.91%，特異度為56.67%（0.900 0 >0.720 5>0.700 0），說明其敏感性高、特異性相對較好，這與吳東等[10]研究結果顯示的診斷進展期腺瘤的敏感度為67.6%，特異度為47.4%相似。說明mSEP9 檢測可以用于結直腸腺瘤篩查，并且因為其檢測方法便捷、患者依從性較好，從而對結直腸癌的早期診斷具有良好的臨床推廣作用。

3.2 檢測平臺，檢測方法靈敏性，特異性及臨床應用

本研究利用甲基化特異性引物和Taqman 特異性熒光檢測技術基于實時熒光定量PCR 平臺對外周血進行mSEP9 的檢測，證實了其在結直腸腺瘤中的敏感性及特異性。也有部分學者通過改進或創新，研究新的檢測平臺以達到更好的操作接受度和更多的臨床應用。如Ma Z Y 等[11]研究顯示mSEPT9 率、甲基化豐度及CEA 的水平在結直腸癌患者中比正常對照組高，有統計學差異，在CRC 中甲基化發生率及豐度的曲線下面積分別為0.707 和0.710。甲基化豐度從近端到遠端結直腸癌中有增加的趨勢，差異具有統計學意義；術后3 個月，甲基化率、甲基化豐度都有下降，尤其在三期及直腸癌中明顯，差異均具有統計學意義。另外也有學者研制出一個微滴式數字PCR 平臺可對結直腸癌病人血漿SEP9 進行定量的檢測。SEP9 甲基化豐度早期術后下降，這可能用于監測術后治療反應的有效性[12]。Qiu Liang 等[13]研制了一種檢測雙鏈DNA 的新型mSEPT9 檢測方法，在這個方法中甲基化DNA 連同質控基因的特異序列能夠在一個反應中得到擴增及檢測，對結直腸癌發生的敏感性及特異性分別為77.4%，97.8%，對于臨床早期結直腸癌檢測有更好的診斷價值。此外，也有研究者探索mSEPT9 檢測聯合不同的標記物，檢測其在腫瘤中的表達情況。如LEI ZHANG 等[12]通過聯合SEPT9 甲基化與編碼蛋白基因Synuclein Gamma（SNCG）檢測，發現其在食道癌中不同分期表達存在差異，聯合檢測敏感性有所提高。總之，甲基化在部分癌癥發生的過程中發揮著重要作用，通過單獨或聯合篩查篩出早期病變如腺瘤等是筆者努力探索的方向。

3.3 mSEPT9 陽性界定值及如何提高檢測敏感度及特異度

本研究中，外周血mSEPT9 檢測受試者特征曲線顯示SEP9 在CT 值為39.55 是分界值，這與試劑盒建議的小于41 為陽性有一定的差異，筆者分析這與本研究總體樣本量較小，而且是單中心研究結果有一定的關系，而且可能與本研究結果主要針對的是結直腸癌早期病變-結直腸腺瘤有關，尚需增大樣本量、多中心的研究進一步證實。同時，在39.55 分界值時候敏感度為90.91%，特異度為56.67%，敏感度較高、而特異度不是很強。因此，在結直腸腺瘤或結直腸癌早篩的過程中，可以通過多個標記物的聯合檢測以提高敏感性及特異性，FEI XU 等[14]通過聯合檢測mSEP9 和支鏈氨基酸轉氨酶1（branched chain amino acid transaminase 1，BCAT1）對于結直腸癌的診斷敏感性可達83.7%，特異性可達93.9%，曲線下面積為0.908。目前，報道稍多的是SEP9 基因甲基化聯合大便隱血免疫法（fecal immunochemical test，FIT）檢測，H.W 等[15]聯合 FIT 和DNA 甲基化檢測（包括mSEPT9），對結直腸癌敏感性提高到81.5%，曲線下面積為 0.93，優于單獨的FIT，差異具有統計學意義，而對腺瘤的敏感性為 27.8%，特異性為94.4%，多維檢測在不同階段的腫瘤中的敏感性及特異性也不同。因此，探討更便捷和經濟的聯合檢測方式篩查結直腸腺瘤依然是待解決的問題。可以通過多中心、大樣本、多分層的研究得到更加經濟有效的檢測方法，使陰性檢測者不必接受腸鏡等侵入性檢查，而結直腸腺瘤患者能夠更有針對性接受腸鏡檢查，從而大范圍減少由腺瘤惡變為癌的可能。

3.4 結直腸腺瘤中mSEPT9 與外周血CEA 敏感性及特異性的比較

目前，臨床常用篩查結直腸癌的方法主要是檢測外周血腫瘤標記物，如 CEA、CA19-9、CA125 等，而這些標記物一般可在多種惡性腫瘤中有不同程度的升高因此對結直腸癌的診斷特異性較差。尤其是在結直腸癌發生的早期病變-腺瘤中的敏感性及特異性則更不明顯，這在筆者的研究中也得到證實。本研究在結直腸腺瘤中外周血CEA 檢測的受試者特征曲線顯示曲線下面積為0.533，P值為0.683 7（>0.05），差異無統計學意義，因此，不能單獨將外周血CEA 檢測用于結直腸腺瘤的篩查。

3.5 低級別與高級別腺瘤mSEPT9 的比較

在結果中經過Fisher 精確統計，低級別與高級別腺瘤mSEPT9 陽性例數差異無統計學意義，這也許并不能完全代表真實的客觀情況，因為此次受試者樣本量少尤其高級別腺瘤組受試者樣本量很少，只有5 例，通過這次研究入組對象等分析在后續的研究中納入腺瘤更細分類入組及增加入組樣本數量，并進行多中心研究對于得到更加客觀的結論非常重要，只有這樣得到的結論才更能分層分類指導臨床推廣應用。

綜上所述，在結直腸癌早期病變-腺瘤的早期篩查中，本研究結果一定程度上為臨床優先進行mSEPT9 檢測進行有效分層管理，再對陽性人群進行侵入性腸鏡檢查提供了一定的理論基礎，這樣一定程度上可增加結直腸癌或腺瘤早期篩查的陽性診斷率，并可增加該類篩查人群對腸鏡檢查的接受度及相應減少腸鏡侵入性檢查的有可能造成的并發癥風險。

本研究有一定的局限性，首先是樣本量相對較少，其次是沒有進行多因素的分析，因此研究結果外周血mSEPT9 檢測對預測結直腸腺瘤有較高的敏感性，和相對較好特異性的結論要慎重解讀，后續項目組可通過優化如納入更細分層，入組更多樣本量、多中心、多因素分析及聯合其他檢測項目對結直腸腺瘤進行早期預測及診斷研究，以期為結直腸癌早期病變-腺瘤篩查診斷及管理提供更好的檢測保障。