1 800 MHz 電磁輻射暴露對大鼠海馬GFAP 表達的“窗口效應(yīng)”

徐曉霜 ，熊 慶 ，張 媛 ，武慧欣 ，和麗梅 ，木云珍

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 昆明 650500;2）云南省疾病預(yù)防控制中心環(huán)境衛(wèi)生所，云南 昆明 650500;3）昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究院，云南 昆明 650500）

隨著科技的發(fā)展，電磁相關(guān)產(chǎn)品越來越多，人們更加頻繁的暴露于電磁輻射（electro magnetic radiation，EMR）中，尤其是用于通信的射頻電磁場（RF-EMFs，30 kHz-300 GHz），EMR 可能引起的健康問題也逐漸被廣泛關(guān)注，特別是對大腦的影響。大腦中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)被確定為最容易受到微波輻射的影響，海馬體特別敏感[1]。膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（glial fibriliary acidic protein，GFAP）是大腦組織中的成熟星形膠質(zhì)細胞所特有的細胞骨架蛋白，它在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能和正常結(jié)構(gòu)方面有極其重要的作用，GFAP 的表達水平升高被認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損重要檢測指標(biāo)之一[2]。電磁波生物學(xué)“窗口效應(yīng)”是指只有特定功率密度的電磁輻射使生物體產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[3]。而EMR 對人體系統(tǒng)的影響可能取決于輻射的頻率、強度和功率，但影響GFAP 的表達的輻射閾值并無清楚報道，本研究通過控制EMR 的頻率和強度，而改變功率密度，探究在1 800 MHz電磁輻射暴露SD 大鼠下，不同的功率密度海馬組織中GFAP 的表達。

1 材料與方法

1.1 動物分組及電磁輻射暴露

98 只4 周齡SPF 級，雌雄各半的健康SD 大鼠，采取完全隨機方法分配7 個對照組和7 個暴露組，每組7 只。動物電磁波暴露分7 批進行，每批一個強度的暴露組（分別對應(yīng)E0.1、E0.3、E0.5、E0.7、E0.9、E1.0、E1.2 7 組，功率密度分別為0.1 mW/cm2、0.3 mW/cm2、0.5 mW/cm2、0.7 mW/cm2、0.9 mW/cm2、1.0 mW/cm2、1.2 mW/cm2）和每個暴露組對應(yīng)一個對照組進行虛擬暴露（均為E0.0，功率密度為0 mW/cm2）。本研究通過昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理審查（批號：kmmu-2020250）。

實驗前使用Model7620 微波輻射測試儀測定暴露室的本底強度。暴露時間每天固定20:00～8:00，持續(xù)21 d，控制實驗室物理環(huán)境條件。本實驗設(shè)置采用盲法，暴露的強度由本項目負責(zé)人設(shè)置，動物電磁波暴露操作人員和GFAP表達測定人員以及統(tǒng)計分析人員均不知道動物暴露的分組和強度，待所有實驗完成以及統(tǒng)計分析結(jié)束后揭盲。

1.2 暴露裝置

參照德國電信公司，按照提供給德國國家環(huán)境與健康研究中心的毒理所的標(biāo)準(zhǔn)--歐洲數(shù)字式GSM 移動通信暴露室而自制的暴露室。可對暴露裝置設(shè)置產(chǎn)生頻率為800～2 400 MHz 微波及不同的功率密度。

1.3 主要儀器設(shè)備和測定試劑

Model7620 微波輻射測試儀（美國Narda 公司），TES 電場測試器（中國臺灣泰仕電子工業(yè)有限公司），CM1900 冰凍切片機（德國萊卡公司），Nikon 90i 電子攝影顯微鏡（日本尼康公司），Image Pro Plus6.0（IPP6.0）圖像分析系統(tǒng)（美國Medical Cybernetics 公司），Amersham Imager 680超靈敏多功能成像儀（美國GE Health 公司），兔抗鼠GFAP 多克隆抗體試劑（美國MILLIPORE 公司），即用型山羊抗兔SP 免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。實驗前配置好濃度為4%的多聚甲醛溶液，蔗糖溶液，0.1 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）緩沖液，0.01 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液。

1.4 免疫組化測定大鼠海馬組織GFAP

將暴露完成的大鼠用4%的戊巴比妥鈉（0.0015 L/1kg）腹腔麻醉，打開大鼠的胸腔后，經(jīng)過左心室做主動脈插管延伸至升主動脈，以0.002 L/min 速度灌注4%的多聚甲醛溶液30 min，對大鼠腦組織內(nèi)固定。隨后分離大鼠腦組織浸入4%的多聚甲醛溶液中，置于4 ℃冰箱后固定。將腦組織用梯度蔗糖溶液脫水，將海馬組織從大鼠腦組織中剝離。最后在-20 ℃下用CM1900 冰凍切片機沿著海馬組織長軸進行連續(xù)切片，每份切片的厚度均保持在20 μm，每只大鼠作20 張海馬組織切片，隨機選取3 張冰凍切片進行免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法（streptavidin-peroxidase method，SP 法）染色。在保證所有免疫組化法染色切片的背景吸光度值相同的情況下，在100 倍顯微鏡下隨機選取海馬DG 區(qū)、CA3 區(qū)和CA1 區(qū)，每區(qū)選擇2 個視野在400 倍下進行攝片。攝取后照片采用IPP6.0 圖文分析系統(tǒng)測定GFAP 表達量的平均光密度（mean optical density，MOD）值表示，MOD 值越大，表示攝片區(qū)域相關(guān)蛋白表達量越大，每只動物在海馬各區(qū)的GFAP 表達量是攝取的合計6 個視野MOD值的平均值。

1.5 Western Blot 測定大鼠海馬組織GFAP

各組的大鼠頸椎脫位后，取海馬組織加入500 μL RIPA 裂解液和5 μL 蛋白酶抑制劑，利用超聲破碎儀破碎海馬組織15～20 s，隨后以12 000 r/min 離心取上清液。通過BCA 蛋白定量法測定蛋白含量，將每組樣品加入5x 上樣緩沖液，100 ℃煮15 min。取5 μL 裂解樣品進行電泳分離，之后將分離的蛋白濕轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。快速封閉液在常溫下?lián)u床封閉10 min。隨后，GFAP（1∶1 000）和GAPDH（1∶10 000）一抗，4 ℃過夜孵育。二抗常溫孵育2 h。最后，采用顯色成像技術(shù)，并使用Image J 軟件對成像結(jié)果進行灰度值量化分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 19.0 軟件建立數(shù)據(jù)庫并進行統(tǒng)計分析，GFAP 表達值MOD 值用（）表示。大鼠的性別比以及體重分別用χ2檢驗和單因素方差分析進行統(tǒng)計分析。對照組和暴露組的MOD 值和相對蛋白表達量用兩獨立樣本t檢驗或完全隨機設(shè)計兩樣本秩和檢驗，檢驗水準(zhǔn)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 實驗大鼠的基本情況

7 批大鼠暴露期間無死亡，無患病且無異常活動。暴露結(jié)束后動物大體解剖和心，肝，肺，腎，胰，脾，生殖系統(tǒng)，大腦病理檢查無異常。大鼠性別和體重，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 實驗大鼠的基本情況[（），n=7]Tab.1 Basic information of experimental rats[（），n=7]

表1 實驗大鼠的基本情況[（），n=7]Tab.1 Basic information of experimental rats[（），n=7]

2.2 免疫組化檢測GFAP 在SD 大鼠海馬組織各區(qū)的表達

SD 大鼠海馬組織冰凍切片進行免疫組化法染色，GFAP 在各個視野中均有表達，GFAP 陽性染色呈棕色，星形膠質(zhì)細胞纖維清晰可見，呈現(xiàn)典型的“蜘蛛樣”形態(tài)，各組間均未見明顯的陽性細胞形態(tài)和數(shù)量的變化，見圖1。各組MOD 值暴露組E0.1 和E0.3 的3 個區(qū)GFAP 表達的MOD 值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表2。

圖1 GFAP 在大鼠海馬CA1 區(qū)的表達（×400）Fig.1 Expression of GFAP in the CA1 region of the rat hippocampus.（×400）

表2 14 組大鼠海馬3 個區(qū)GFAP 表達的MOD 值（，n=7）Tab.2 MOD values of GFAP expression in three areas of the hippocampus of rats in 14 groups（，n=7）

表2 14 組大鼠海馬3 個區(qū)GFAP 表達的MOD 值（，n=7）Tab.2 MOD values of GFAP expression in three areas of the hippocampus of rats in 14 groups（，n=7）

*P <0.05。

2.3 GFAP 在14 組大鼠的海馬蛋白表達比較

和對照組相比，Western Blot 電泳檢測1 800 MHz 對大鼠海馬GFAP 表達的影響。結(jié)果顯示，暴露組E0.1 組和E0.3 組海馬組織中GFAP的表達顯著高于對照組（P<0.01），且E0.1 組海馬組織中GFAP 的表達顯著高于E0.3 組，見圖2。

圖2 14 組大鼠海馬GFAP 蛋白表達表達結(jié)果Fig.2 Expression of GFAP protein in the hippocampus of rats in 14 groups

3 討論

RF-EMF 主要來源于電視信號的發(fā)射與接收、無線電通訊、廣播等[4]。手機和基站所發(fā)出的頻率為1 800 MHz，對人體組織穩(wěn)態(tài)有長期、短期的影響，尤其是對大鼠蛋白組成的影響[5]。據(jù)報道基站的輻射功率密度為0.6 mW/cm2到2.1 mW/cm2[6]，其中1 800 MHz 的功率密度限值為0.9 mW/cm2[7]。本次所選擇的7 個暴露組的功率密度是基于以上綜合考慮后的結(jié)果。在張盛慶宇、陳潔[8-9]等，研究中表示1 800 MHz 的電磁輻射后，增加了大腦海馬中的GFAP 表達。現(xiàn)目前的研究中表明1 800 MHz 的電磁輻射對GFAP 的表達確實有影響，但卻未明確其輻射功率密度，為了找到功率密度中的窗口，本研究將輻射功率密度分為7 個組，目的是篩選出功率密度窗，明確在多少功率密度下1 800 MHz 可對GFAP 造成影響。

3.1 在1800MHz 電磁波暴露對GFAP 表達的影響是非線性的

動物實驗研究表明，在高功率密度射頻輻射的實驗條件下大鼠的記憶功能受影響，GFAP 的表達上升[10]。楊美麗等[11-13]學(xué)者的研究顯示850～1 900 MHz 產(chǎn)前手機輻射會使大鼠后代GFAP 表達上調(diào)。馬卿鑫和張盛慶宇等[3，9]學(xué)者研究1 800 MHz電磁波暴露對大鼠GFAP 表達的影響，兩者的研究結(jié)果顯示不同功率密度的電磁波暴露會使大鼠海馬各區(qū)的GFAP 表達發(fā)生改變，表達下降或上升。本實驗最終結(jié)果表明，功率密度為0.1 mW/cm2和0.3 mW/cm2的電磁波暴露使大鼠海馬各區(qū)GFAP表達出現(xiàn)上調(diào)，其余功率密度對GFAP 表達無明顯影響。由此可知，在該頻率電磁輻射條件下產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)是非線性的，提示在1 800 MHz下隨著電磁波功率密度增加并不會產(chǎn)生更大的生物學(xué)效應(yīng)。

3.2 1 800 MHz 電磁波暴露對大鼠海馬GFAP 表達的影響具有“窗口效應(yīng)”

現(xiàn)有研究表明手機的電磁輻射的功率密度對生物體的影響是有選擇性的，張媛，劉松等[14-15]與本研究相同裝置產(chǎn)生的1 800 MHz 的電磁輻射，輻射功率密度為0.5 mW/cm2和1.0 mW/cm2的SD 大鼠出現(xiàn)心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)，可由此推，相應(yīng)的功率密度可能對大腦的海馬也有一定影響。本次結(jié)果顯示為0.1 mW/cm2和0.3 mW/cm2的暴露組與對照組相比，大鼠海馬各區(qū)GFAP 表達出現(xiàn)上調(diào)，根據(jù)密度窗的定義，可將功率密度為0.1 mW/cm2和0.3 mW/cm2認定為1 800 MHz 電磁輻射暴露下SD 大鼠海馬組織的GFAP 升高的功率密度窗。本研究為動物實驗研究，得到的結(jié)果有局限性，能否將此種影響外推于人還需要更多流行病學(xué)研究證實。