ERK1/2 信號通路基因3'UTR 多態性與非小細胞肺癌的相關性

洪 超 ，向旭東 ，李盈甫 ，曹 楊 ，陳雪雅 ，李 帥 ，邢安灝 ，林 牧 ，馬千里

（1）中國醫學科學院 &北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南 昆明 650118;2）昆明醫科大學第三附屬醫院胸外科，云南 昆明 650118;3）昆明醫科大學第一附屬醫院干療科，云南 昆明 650032;4）云南省保山市第二人民醫院檢驗科，云南 保山 678000）

2020 年，全球估計有220 萬肺癌新發病例和180 萬死亡病例，約占癌癥診斷的十分之一（11.4%）和死亡的五分之一（18.0%）[1]。2016 年我國癌癥統計報告顯示，肺癌是男、女性癌癥死亡的最常見原因，約占男性癌癥死亡的29.71%和女性癌癥死亡的22.92%[2]，這主要是因為肺癌早期癥狀隱匿，難以實現早期診治[3]。肺癌的發生受多種因素影響[4]，而其中遺傳因素是影響個體間肺癌易感性差異的最主要因素[5]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是常見的肺癌類型，約占肺癌的85%[6]，NSCLC 預后較差，且近年來發病趨于年輕化[7]。研究發現，有多條信號通路參與了NSCLC 的發生發展過程，如CDKN2A/RB1、NFE2L2/KEAP1/CUL3、PI3K/AKT、SOX2/TP63/NOTCH1 等[8-10]。這些信號通路相關基因中的單核苷酸多態性位點（single nucleotide polymorphisms，SNPs）可能與NSCLC 的發生發展有相關性[11]。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路在腫瘤發生過程中起關鍵作用，與腫瘤發生的多個方面有關，包括細胞分化、增殖、侵襲、血管生成、凋亡和轉移[12]。細胞外信號調節激酶（ERK）是3 個MAPK 家族（JNK，p38/SAPK 和ERK）之一[13-15]。ERK1/2 通路也被稱為經典的MAPK 信號傳導途徑，約在34%的腫瘤中發生改變[16]。研究發現，位于基因3'非翻譯區（3'untranslated region，3'UTR）的SNP可能會影響miRNA-mRNA 相互作用[17-18]，進而影響靶基因的表達，可能在腫瘤的發生中發揮關鍵作用[19]。本研究選取了4 個ERK1/2 信號通路基因3'UTR 區域的SNP 位點（MAPK1基因中的rs9340，NRAS基因中的rs14804，KRAS基因 中的rs712 和rs7973450），探討其與NSCLC 遺傳易感性的相關性，以期為肺癌的分子病理機制的探究提供數據支持。

1 資料與方法

1.1 研究對象

隨機選取在昆明醫科大學第三附屬醫院診斷的478 名NSCLC 患者，納入標準為：患者經活檢或手術診斷為NSCLC、臨床資料完整、具有較好的依從性、無其他合并腫瘤、無其他腫瘤既往史、未接受放療或化療等抗腫瘤治療。診斷標準依據《中華醫學會肺癌臨床診療指南（2018 版）》[20]。同時隨機選取480 名同期健康體檢人員作為健康對照組。采集所有受試者的乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝全血4 mL。所有樣本收集均獲得患者及家人的知情同意，并經昆明醫科大學第三附屬醫院倫理委員會批準（審查編號：KYLX2022180）。為了響應我國對肺癌篩查與早診早治的倡議，根據《中國肺癌篩查與早診早治指南（2021，北京）》[21]以及《老年晚期肺癌內科治療中國專家共識（2022 版）》[22]的推薦，本研究將受試者按照年齡劃分為 <50 歲組，50～65 歲組以及>65歲組。

1.2 DNA 提取

使用全血基因組DNA 提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit（購自Qiagen 公司，Qiagen NV，Venlo，Netherlands），根據試劑說明書完成基因組DNA提取。使用Multiskan GO 全波長酶標儀測定DNA濃度及純度。將提取到的DNA 樣本稀釋到25 ng/μL的工作濃度，用于隨后的基因分型檢測。

1.3 SNP 選取及分型

使用CAPD 數據庫（http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CPAD/index.jsp）選取與肺癌相關的候選信號通路，利用GEPIA 數據庫（http://gepia.cancerpku.cn/）對信號通路中的候選基因進行表達驗證，使用Ensembl 數據庫（https://www.ensembl.org/index.html）及UCSC 數據庫（https://genome.ucsc.edu/）查找位于候選基因3'UTR 區域的SNP 位點。同時以中國南方漢族人群次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）高于0.04 作為篩選標準。最終選取4 個SNP 作為本次研究的候選SNP，分別是位于MAPK1基因 3'UTR 區域的 rs9340，位于NRAS基因3'UTR 區域的rs14804，位于KRAS基因3'UTR 區域的rs712 和rs7973450，見表1。

表1 所選SNP 位點信息Tab.1 The information of selected SNPs in the current study

使用TaqMan 探針法對上述SNP 進行基因分型檢測，所用試劑及探針均購自美國ABI 公司，具體分型方法參見筆者之前的研究[23]。為驗證基因分型結果的準確性，本研究隨機挑選5%的樣本進行重復檢測，并隨機挑選了3%的樣本進行測序驗證。

1.4 生物信息學分析

利用GTEx 數據庫（https://www.gtexportal.org/home/）評估SNP 和基因表達的相關性，使用miRNASNP 數據庫（http://bioinfo.life.hust.edu.cn/mi-RNASNP/#!/）預測基因3'UTR 變異對miRNAmRNA 相互作用的影響。

1.5 統計學處理

使用Microsoft Excel 軟件整理所有基因分型數據以及臨床信息，采用Graphpad Prism 軟件和在線軟件SHEsis[24]進行統計學分析。研究對象年齡以（）表示，性別、病理類型、臨床分期、SNP 位點等位基因及基因型以例數和百分比[n（%）]表示。使用獨立樣本t檢驗分析病例組和對照組間樣本年齡差異；使用χ2檢驗分析2 組間性別分布差異；采用哈迪溫伯格平衡（hardyweinberg equilibrium，HWE）檢驗分析納入樣本的群體代表性；采用χ2檢驗分析各SNP 位點等位基因及基因型在各組間的分布頻率的差異及優勢比（odd ratio，OR），檢驗水準α為0.05。對于多重比較，使用Bonferroni 校正P值，本次研究設定P值為0.012（0.05/n，n=4）。假陽性報告概率（false positive report probability，FPRP）分析[25]用于評估研究結果中假陽性發生的概率。

2 結果

2.1 臨床特征

本研究共納入958 名受試者，包括478 名NSCLC 患者，平均年齡為（55.94 ± 10.79）歲，其中男性305 名，女性173 名。健康對照組包含480 名受試者，平均年齡為（55.16 ± 11.35）歲，其中男性277 名，女性203 名。2 組受試者之間的年齡和性別分布比較差異無統計學意義（t=1.09，P=0.275;χ2=3.74，P=0.053），見表2。

表2 受試者臨床信息[/n（%）]Tab.2 The clinical characteristics of the subjects enrolled in the current study [/n（%）]

表2 受試者臨床信息[/n（%）]Tab.2 The clinical characteristics of the subjects enrolled in the current study [/n（%）]

2.2 4 個SNP 與肺癌的相關性分析

位于ERK1/2 信號通路相關基因3'UTR 區域的4 個SNP 的基因型在對照組中的分布特征均符合HWE（P>0.05），表明本研究納入樣本是具有群體代表性的隨機樣本。對4 個SNP 位點等位基因和基因型在對照組與NSCLC 組中分布頻率的差異進行分析，結果顯示，4 個SNP 的等位基因和基因型在對照組與NSCLC 組中分布頻率的差異經Bonferroni 校正后，差異無統計學意義（P>0.012），見表3。

表3 在健康對照組和NSCLC 組中4 個SNP 位點等位基因及基因型頻率分布結果[n（%）]Tab.3 Allele and genotype frequencies of four SNPs between the control group and NSCLC group [n（%）]

2.3 4 個SNP 與不同病理類型的肺癌相關性分析

為了探究ERK1/2 信號通路相關基因3'UTR區域的4 個SNP 與不同病理類型NSCLC 的相關性，本研究按照病理類型將NSCLC 組分為腺癌組（adenocarcinoma，AC）和鱗狀細胞癌組（squamous cell carcinoma，SCC），并分析4 個SNP 位點的等位基因和基因型在對照組與AC 組以及對照組與SCC 組中分布頻率的差異。結果顯示，rs9340 位點的等位基因在對照組與SCC 組中分布頻率的差異具有統計學意義（P=0.009），在先驗概率水平為0.25 時，rs9340 與SCC 的相關性仍有意義（FPRP=0.045），該結果表明rs9340 位點的G 等位基因可能是非小細胞肺鱗癌的保護性因素（OR=0.67，95%CI:0.50～0.91），而其余位點的等位基因和基因型在對照組與各病理類型組間分布頻率的差異經Bonferroni 校正后均無統計學意義（P>0.012），見表4。

2.4 4 個SNP 與不同分期的肺癌相關性分析

為分析ERK1/2 信號通路相關基因3'UTR 區域的4 個SNP 位點與NSCLC 不同臨床分期的相關性，本研究按臨床分期將NSCLC 組分為I+II 期組以及III+IV 期組，并分析4 個SNP 位點等位基因和基因型在對照組與I+II 期組以及對照組與III+IV 期組中分布頻率的差異。結果顯示，4 個SNP 位點的等位基因和基因型在對照組與I+II 期組以及對照組與III+IV 期組中分布頻率的差異經Bonferroni 校正后差異無統計學意義（P>0.012），見表5。

2.5 4 個SNP 在不同年齡段人群中與肺癌的相關性分析

為了分析ERK1/2 信號通路相關基因3'UTR區域的4 個SNP 位點在不同的年齡組中與NSCLC 的相關性，本研究分析了4 個SNP 位點等位基因和基因型在 <50 歲組、50～60 歲組以及 >65 歲組中分布頻率的差異。結果顯示，在 <50歲年齡組中，rs9340 位點的等位基因在對照組和NSCLC 組中的分布頻率差異具有統計學意義（P=5.07×10-4），在先驗概率水平為0.25 時，rs9340與 <50 歲年齡組中NSCLC 的相關性仍有意義（FPRP=2.52 × 10-4），該結果表明rs9340 等位基因G 可能是NSCLC 的保護性因素（OR=0.46，95%CI:0.29～0.72），見表6。

2.6 rs9340 功能預測分析

在獲得rs9340 位點可能與NSCLC 發生風險具有相關性的結果后，本研究利用生物信息學工具對rs9340 位點的功能進行初步預測，結果顯示，rs9340 位點的A 等位基因可使培養的成纖維細胞中MAPK1基因表達升高，見圖1。在miRNAmRNA 相互作用方面，rs9340 位點的A 等位基因可能在MAPK1基因3'UTR 區域增加了與hsa-miR-153-3p、hsa-miR-448 的結合位點，同時影響了與hsa-miR-521 的結合。該結果表明，rs9340 位點可能是通過影響MAPK1基因的表達而在NSCLC 的發生過程中發揮作用。

圖1 rs9340 調節MAPK1 的表達Fig.1 rs9340 regulates the expression of MAPK1

3 討論

ERK1/2 信號通路參與多個細胞生物學進程的調控，包括增殖、分化和轉化[26]，異常激活的ERK1/2 信號通路可以促進癌細胞的增殖、抑制凋亡、促進血管生成和細胞遷移等，從而促進腫瘤的生長和轉移[27-28]。更重要的是，ERK1/2 信號通路深度參與癌癥治療中的放射抵抗[29]，可能與腫瘤不良預后相關。研究發現，腫瘤相關信號通路基因中的突變在腫瘤發生發展過程中發揮著重要作用[30-31]，這些突變通常與信號通路基因表達及功能的改變相關[32-33]，其中位于基因3'UTR區域的SNP 可能會通過影響miRNA-mRNA 的相互作用[34]，而影響信號通路基因的表達[35]，進而產生級聯反應[36]，并在疾病的發生發展過程中發揮作用[37]。因此，本研究選取了4 個位于ERK1/2信號通路的基因3'UTR 區域的SNP 位點，研究其與NSCLC 發生風險的相關性。

絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）是研究廣泛的MAP 激酶家族成員，也被稱為細胞外信號調節激酶2（ERK2）[38]。在正常生理條件下，MAPK1在大多數組織中呈中度持續表達，但在乳腺癌、膀胱癌、肺癌和胃癌等多種惡性腫瘤中表達會發生顯著變化[39-40]。Wang 等[41]的實驗證實，MAPK1可以雙向調控靶基因，從而促進胃腺癌細胞的侵襲和遷移。Zhu 等[42]報道，MAPK1在宮頸癌患者中表達上調，MAPK1逆轉了miR-217 對細胞活力、遷移、侵襲和凋亡的抑制。Gagliardi 等[43]的研究結果表明，ERK2可以促進三陰性乳腺癌細胞的遷移和侵襲、腫瘤干細胞表型形成和轉移。以上研究資料表明MAPK1基因的表達異常在腫瘤發生中發揮重要作用。而rs9340 位點位于MAPK1 基因的3'UTR，可能參與MAPK1的轉錄后調控，而與疾病的發生相關。Guo 等[44]對MAPK1基因中的rs9340 的研究結果顯示，rs9340 位點的G 等位基因與降低圍絕經期冠心病的易感性顯著相關。Insodaite 等[45]的結果表明，rs9340 位點基因型A/A 是喉鱗癌患者發生遠處轉移的風險因素。同樣，本研究結果顯示rs9340 可能與非小細胞肺鱗癌的發生風險具有相關性，其中等位基因G 可能是非小細胞肺鱗癌的保護性因素。本研究生物信息學相關分析結果提示rs9340 位點可能會影響miRNA 與MAPK1基因3'UTR 區域的相互作用，并與MAPK1基因的表達相關，這可能是該位點與非小細胞肺鱗癌發生風險相關的機制。非小細胞肺鱗癌與其他類型肺癌相比，預后不理想，并且缺乏可用的靶向藥物，往往對免疫治療的敏感性較低[20，46-47]，結合本研究的發現，未來應繼續在更大規模人群中分析rs9340 位點與非小細胞肺鱗癌的相關性，并通過功能研究探究相關機制，為該位點在非小細胞肺鱗癌早期診斷及預后分析中的應用提供必要的指導。

此外，本研究結果還顯示，在 <50 歲人群中，rs9340 位點與NSCLC 發生風險相關。肺癌是全球及我國60 歲以上人群發病率及死亡率最高的惡性腫瘤[48]，考慮到我國肺癌發病年齡較早，《中國肺癌篩查與早診早治指南》建議我國的肺癌篩查起始年齡為50 歲[21]。因此，未來有必要開展更多研究探討MAPK1基因3'UTR 區域的rs9340 位點在50 歲以下人群的NSCLC 風險預測中的應用。

綜上所述，本研究分析了4 個位于ERK1/2信號通路基因3'UTR 區域的SNP 位點與NSCLC發生風險的相關性。研究結果初步揭示了位于MAPK1基因3'UTR 區域的rs9340 位點與NSCLC發生風險的相關性及其可能的機制，未來應在此基礎上進一步開展更大樣本量的相關性研究以及功能研究，闡明該位點在肺癌發生過程中發揮的作用及其機制，為該位點在肺癌的早期診斷及治療中的應用提供研究基礎。