觀賞蕨類姬蕨同配子體自交的孢子體萌發(fā)和發(fā)育特性

李 莉，楊春萍，商 輝*

（1.上海辰山植物園，華東野生瀕危資源植物保育中心，上海 201602；2.唐山漢沽管理區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務中心，河北唐山 050701）

觀賞蕨類屬于觀葉植物，具有美化、彩化和凈化等功能。別具特色的觀賞特性、耐陰喜濕的生態(tài)習性使蕨類植物在園藝市場上的應用越來越廣泛，需求量也逐漸增大。蕨類植物雖沒有艷麗的花朵，但在色彩、形態(tài)、習性等方面獨樹一幟。如：葉型奇特，從單葉至復葉；形體相差懸殊，小到匍匐地被，大到數(shù)米生長，高大挺拔，生機盎然；孢子囊群造型獨特，圓形、腎形、線形等，其著生部位既有葉脈頂端、亦有葉中部位，變化多端，是種子植物不具備的觀賞價值。此外，蕨類植物的根狀莖、葉片、孢子囊也常常具備獨特的觀賞價值。

蕨類植物在園林綠化中的應用形式多樣。在室內(nèi)以盆栽及微景觀形式應用于大廳、主題會場、家庭及辦公室等；在城市建筑如商場、辦公樓、賓館的庭院綠化、陰生專類園、水景園、家庭庭院布置及城市園林綠化帶可使用蕨類植物作為地被及中下層植物[1-4]。

中國現(xiàn)有蕨類植物38 科，177 屬，2 215 種，228 個種下分類群，其中有1 200 余種屬于中國特有[5-6]。目前國內(nèi)觀賞蕨類在園藝市場上依舊呈現(xiàn)出種類少及應用單一現(xiàn)象。觀賞蕨類植物相比種子植物占比極小，而野生蕨類植物的開發(fā)利用則是補充種類多樣性的有效途徑。

姬蕨（Hypolepis punctata）隸屬于碗蕨科（Dennstaedtiaceae）姬蕨屬（Hypolepis），生長在熱帶亞熱帶區(qū)域，國內(nèi)主要分布于長江中下游及以南地區(qū)，喜溫暖多濕半陰環(huán)境，在棄耕地、山谷溪流邊和林緣、林窗中經(jīng)常可以發(fā)現(xiàn)[7]，是園林觀賞和家庭種植的優(yōu)良物種。早在1994 年姬蕨就是英國最流行的觀賞蕨類植物之一[8]，但在國內(nèi)的應用幾乎沒有。姬蕨植株姿態(tài)飄逸優(yōu)美、適應性強、易繁殖、資源量大，可以作為基礎種植材料應用于園林綠化中，也可應用于陰暗角落或高大喬木下較陰暗處，特別是在園林中較難處理的墻邊、籬邊、路邊的配置。飄逸優(yōu)美的羽狀復葉還可以作為切花配葉。總之，姬蕨具有較好的園藝市場應用前景。

目前姬蕨的人工擴繁以孢子萌發(fā)培養(yǎng)為主。由于配子體產(chǎn)生精子器和頸卵器的時期不同，甚至有些配子體可能一生只產(chǎn)生精子器，這使得在孢子批量混播的情況下，精卵結(jié)合絕大多數(shù)情況下發(fā)生在不同配子體之間，即配子體間。然而，園藝上進行觀賞蕨類的培養(yǎng)，混播的方式很難保證性狀的穩(wěn)定性。為保持優(yōu)良蕨類品種的性狀穩(wěn)定性，許多蕨類開展了組培快繁技術(shù)，如波斯頓蕨[9]。可以通過對單個孢子進行培養(yǎng)，或在配子體產(chǎn)生精子器和頸卵器前移栽進行單獨培養(yǎng)，人為創(chuàng)造條件進行配子體內(nèi)自交，從而保障品種性狀的穩(wěn)定性。但由于蕨類生活史的特性，配子體內(nèi)自交可產(chǎn)生基因組上所有等位基因完全的純合子，可能面臨著較嚴重的近交衰退[10]，因此該蕨類植物繁殖方案需要繁殖生態(tài)學的評估。

蕨類的擴散，一般認為是以風力為主導，特別是一些大洋島嶼的蕨類植物分布證據(jù)，使得風的長距離傳播能力得以印證[11]。風媒傳播下，單個孢子的傳播將不可避免，配子體上頸卵器成熟時將無法得到其他配子體的精子，而不得不進行配子體內(nèi)自交。所以借助風力進行種群擴張的同型孢子蕨類建立的新種群，配子體內(nèi)自交占主導，遺傳多樣性低下。許多試驗證明，自交對于同型孢子的蕨類植物繁殖不利。人們普遍認為蕨類植物孢子萌發(fā)后同配自交是有害的，異交才是蕨類配子體主要的繁殖模式[12-13]。

絕大多數(shù)蕨類植物產(chǎn)生同型孢子，即其孢子萌發(fā)產(chǎn)生的配子體既可以長出精子器產(chǎn)生精子，也可以長出頸卵器產(chǎn)生卵細胞，因此蕨類植物的交配模式可分為3 類：異配異交，即來源不同母本的配子體間的精卵結(jié)合；異配自交，即來源同一母本的配子體間的精卵結(jié)合；同配自交，即同一配子體間的精卵結(jié)合[10]。蕨類植物的孢子散播之后，大部分都散落在母株附近，只有小部分孢子長距離散播到其他地方。近距離散播孢子發(fā)育成配子體后，周邊以來源于相同母株的配子體為主，少量同其他植株來源的配子體，所以交配模式以異配自交為主、異配異交為輔。長距離散布的孢子，很難落在同種其他孢子旁邊，因此同配自交是其唯一可選擇的繁殖方式。由于遺傳負荷（致死基因或有害基因）的存在，推測同配自交產(chǎn)生的后代適應性可能較弱，甚至直接死亡。但是如果同配自交發(fā)生概率高，可能會產(chǎn)生多代的過濾作用。即有害基因在長期的迭代過程中已經(jīng)被淘汰，同配自交的適合率可能并不一定顯著低下。而在常規(guī)孢子培養(yǎng)中，蕨類的交配系統(tǒng)對產(chǎn)生和質(zhì)量影響不夠重視，單獨孢子培養(yǎng)不常見，而通過混播孢子進行蕨類繁殖，其后代可能來自于異配自交或異配異交，因為無法確定野外收集的孢子是否來自于不同植株，該文統(tǒng)稱它們?yōu)楫惻浠旖弧?/p>

該研究以姬蕨為材料，通過配子體單獨培養(yǎng)的方法，檢測同配自交是否產(chǎn)生嚴重的近交衰退，從而探討該方法在觀賞蕨類品種優(yōu)良性狀保持上是否具有可行性。

1 材料與方法

設計配子體培養(yǎng)試驗，比較單獨配子體和多配子體的孢子體萌發(fā)，即同配自交與異配混交的萌發(fā)狀態(tài)（萌發(fā)率、存活率），孢子體成長情況及生長速率。播種生長情況及步驟如圖1。

圖1 兩種交配系統(tǒng)的處理及播種生長情況

1.1 孢子采收與保存

姬蕨孢子來自于湖南桑植縣野外種群。采集孢子時，取其成熟且尚未開裂的孢子葉，去除葉面雜質(zhì)，置于干凈的信封或硫酸紙袋中，使用變色硅膠于封口袋中干燥5~10 d。收集孢子時，拍打信封或硫酸紙袋致使孢子得以充分脫落，并移至干凈的硫酸紙上，去除多余的葉片及孢子囊群蓋，即可用于培養(yǎng)，或?qū)⑵涫占陔x心管中，置于-20℃冰箱保存[14]。

1.2 播種方法及培養(yǎng)過程

播種時所需基質(zhì)選用經(jīng)過清水浸泡、剪碎的水苔，121℃滅菌鍋20 min，將滅菌后的水苔均勻鋪于組培瓶的底部，壓實，使水苔平整，厚度為2~3 cm，無菌水浸潤，備用。取適量孢子置于2 mL 離心管中，加入5% NaClO 水溶液1 mL，靜置消毒5 min，8 000 r/min 離心5 min，待孢子沉淀后用無菌水沖洗3~5 遍，放入容器中制成懸濁液，均勻噴灑在組培瓶中的水苔上，加上透明蓋。保持培養(yǎng)微環(huán)境溫度為20℃~25℃，白熾燈光1 500 lx，光照12 h/d，濕度保持90%以上。一般5~10 d 后萌發(fā)長出原絲體，后者不斷發(fā)育，形成多細胞原葉體。

1.3 配子體隔離培養(yǎng)試驗設計

待配子體萌出后，性器官精子器未長出之前進行配子體的移植。移栽基質(zhì)選用腐殖土，用網(wǎng)孔直徑小于2 mm的細篩篩出，121℃滅菌鍋滅菌20 min[10]。后將基質(zhì)置于培養(yǎng)皿中，厚度為1 cm。將配子體移植到腐殖土上，使基質(zhì)濕潤，加蓋。成熟配子體上精子器在播種后50 d 左右成熟，頸卵器55 d 左右成熟，卵細胞在播種后2~3 個月完成受精，受精卵發(fā)育成胚胎，進而長成幼孢子體。

其中移植單獨的配子體24 株于單獨的直徑9 cm 培養(yǎng)皿中，作為同配自交處理。另將24 個配子體按5×5 的網(wǎng)格（中間留空）排列移植于15 cm 的培養(yǎng)皿中，作為異配混交處理，如圖1。每天統(tǒng)計2 種交配系統(tǒng)萌發(fā)情況，包括萌發(fā)的正常幼孢子體數(shù)量及萌發(fā)時間記錄，連續(xù)統(tǒng)計36 d。計算2 種交配系統(tǒng)的幼孢子體的萌發(fā)率及萌發(fā)時間。同時每周記錄幼孢子體的存活情況，連續(xù)記錄7 周，計算幼孢子體的存活率。

1.4 孢子體移栽與測量

孢子播種120 d 后幼孢子體長到3~5 cm 時，具有2~3 片真葉即可進行分盆，移栽盆口徑5 cm 左右，基質(zhì)選用體積比5∶1 草炭土和蛭石。保持土壤濕潤，環(huán)境溫度在15℃~25℃，自然光照10~12 h/d，噴水每天1 次，遮蔽保濕，濕度大于70%。做好盆土水分管理、病蟲害管理，以確保植物良好生長。每天測量統(tǒng)計兩種交配系統(tǒng)孢子體生長情況，包括葉片的數(shù)量、寬度及長度，23 d 內(nèi)測量6次（第1、6、11、15、19 和23 天），并計算生長速率和近交衰退系數(shù)（自交混交的差值除以混交的值）。自交和混交個體生長速率的差異用SPSS 軟件進行t 檢驗。待孢子體繼續(xù)長到10 cm 以上，具有10 片以上真葉可換盆至口徑10 cm的盆器中培養(yǎng)，移栽時切記勿傷根，無須去除舊土。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同交配系統(tǒng)下孢子體萌發(fā)及存活率情況比較

姬蕨孢子隔離培養(yǎng)試驗表明，在相同且適宜的人工培養(yǎng)條件下，姬蕨配子體單獨培養(yǎng)后，孢子體萌發(fā)率仍然較高，達到了87.5%；混合培養(yǎng)的孢子在萌發(fā)時間上早于單獨培養(yǎng)4 d，且最終孢子體萌發(fā)率為100%（圖2A）。在萌發(fā)出幼孢子體后，隨著時間的推移，自交的個體存活率在不斷下降，在最終的7 周統(tǒng)計時間內(nèi)，自交個體的存活率已經(jīng)下降到71.4%，最終存活率為62.5%（以配子體總數(shù)為基數(shù)），混交的存活率則依舊是100%（圖2B）。

圖2 兩種交配系統(tǒng)孢子萌發(fā)率（A）及存活率（B）

2.2 不同交配系統(tǒng)下萌發(fā)個體的生長情況

姬蕨的孢子體幼苗經(jīng)過移栽后的生長檢測表明，包括植物的葉片數(shù)量、長度和寬度上一直弱于混交的配子體（圖3）。同時，自交的生長速率也弱于混交個體（圖4），其中葉片長度的生長速率自交個體為（0.13±0.12）cm/d，混交個體為（0.17±0.07）cm/d（P=0.206）；葉片寬度的生長速率自交個體為（0.06±0.04）cm/d，混交個體為（0.09±0.05）cm/d（P=0.036）；葉片數(shù)目的生長速率自交個體為（0.1±0.08）片/d，混交個體為（0.19±0.11）片/d（P=0.003）。近交衰退系數(shù)分別為24.8%、35.1%和46%。

圖3 兩種交配系統(tǒng)幼孢子體生長速率

圖4 兩種交配系統(tǒng)幼孢子體生長速度

3 討論

3.1 同配自交存在近交衰退

單獨培養(yǎng)（同配自交）配子體上開始萌出孢子體的時間晚于混合培養(yǎng)（混交）配子體約4 d，這是因為頸卵器約晚于精子器出現(xiàn)4~5 d，只有等到頸卵器出現(xiàn)后，才會發(fā)生配子體內(nèi)自交。單獨培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的孢子體萌出速度大致相當，最終混合培養(yǎng)的配子體全部萌出孢子體（100%），而單獨培養(yǎng)的孢子體萌出率為87.5%，即24 個配子體中有3 個配子體受精失敗或胚胎死亡，而萌出后又有6 個自交孢子體死亡。這些結(jié)果說明相比于配子體間異交，配子體內(nèi)自交確實存在一定程度的致死率，總致死率為37.5%，配子體可能存在致死基因，在受精為孢子體后，由于形成純合子，在胚胎發(fā)育以及幼苗生長階段發(fā)揮作用，導致胚胎和幼苗死亡。幼苗移栽后的生長狀況，同配自交的孢子體弱于異配異交的孢子體，特別是葉片寬度和葉片數(shù)目具有顯著差異，這說明同配自交具有近交衰退。

3.2 同配自交的近交衰退率對種群延續(xù)的影響

不同于種子植物有大孢子和小孢子的區(qū)別，蕨類具有同形孢子，也就是說單個孢子產(chǎn)生的配子體既可以產(chǎn)生精子，也可以產(chǎn)生卵細胞。蕨類這種特殊的生活史，使得同配自交成為可能，其產(chǎn)生的孢子體基因組上所有的等位基因都會純合。對于完全純合的孢子體來說，只要有一個位點存在有害基因就會發(fā)揮作用，特別地如果是致死基因，會直接導致死亡。而該結(jié)果表明，至少高達62.5%的孢子沒有致死基因（并不是所有的死亡都能歸結(jié)到致死基因，但沒有死亡可以說明沒有致死基因），這說明在野外條件下，單個孢子同配自交的情況也經(jīng)常發(fā)生，在強烈的自然選擇作用下，致死基因得到了有效清除。

而在幼苗生長過程中，雖然同配自交的個體長勢要弱一些。但以異配異交的個體為標準，同配自交的近交衰退率僅為24.8%~46%，這說明在自然條件下，有害（非致死）基因也得到一定程度的清除，使得同配自交的后代仍然保持一定生活力，也使得單個孢子也能在很大概率上延續(xù)種群。筆者將在后續(xù)的培養(yǎng)過程中逐代檢測其生活力的變化趨勢。

3.3 配子體單獨培養(yǎng)在觀賞蕨類繁殖上的應用前景

種子植物育種過程中，往往需要多代自交才可以得到穩(wěn)定的自交系，而對于蕨類植物來說，一次同配自交就可以得到完全純合的個體，這是蕨類植物育種的優(yōu)勢。該試驗所用的孢子皆來自于野外采集，其致死基因和有害基因已經(jīng)得到很大程度的過濾，在人工培養(yǎng)的情況下，可以繼續(xù)進行人工選擇，盡最大程度地清除致死基因和有害基因，同時保留優(yōu)良基因，從而獲得有價值且生命力強壯的園藝品系。

該研究證明了姬蕨同配自交產(chǎn)生的后代仍然具有較高的生活力，通過單獨培養(yǎng)的方式可以在短時間內(nèi)得到完全純合的自交系植株，同時可以得到具有較高觀賞特性和遺傳穩(wěn)定的品系，可作為進一步雜交育種的優(yōu)良親本，在園藝育種方向具有很好的應用價值，為觀賞蕨類的育種提供理論支持。

致謝：感謝嚴岳鴻博士、王瑩、齊新萍、邵文在本研究過程中特別是在孢子繁殖方面給予的幫助；感謝潘向艷對論文修改的建議。