山荊子MbLRK10L1.1基因正調控腐爛病抗性

魯遠 冒霞 王超 孫娥 鄭艷 左存武

摘 要 此前從東北山荊子（Malus baccata）中發現可能參與腐爛病信號響應的WAK基因? MbLRK10L1.1，在此基礎上，擬結合生物信息學分析、表達分析和功能驗證研究其在腐爛病抗性中的作用機制。結果表明，? MbLRK10L1.1響應Valsa mali（Vm）信號，并且在瞬時表達 MbLRK10L1.1后，‘煙富6號果實表面病斑擴散速率明顯減小，? FRK1（Flg22-induced Receptor-like Kinase 1）、TaNOX（Triticum aestivum NADPH oxidase）、? EDS1（Enhanced disease susceptibility 1）等相關抗病基因均有不同程度的上調表達。表明? MbLRK10L1.1可通過JA、SA、SAR以及PTI等途徑正調控果實對腐爛病菌的抗性。

關鍵詞 腐爛?。╒alsa canker）；WAK基因；瞬時表達標記基因

由黑腐皮殼菌（Valsa mali，Vm）引起的腐爛?。╒alsa canker）是中國乃至亞洲蘋果產區最為嚴重的真菌型病害之一，主要危害枝干、果實等組織，導致產量和果實品質下降[1]。隨著蘋果種植面積不斷擴大，腐爛病成為制約國內蘋果產業可持續發展的重要因素之一 [2]。目前提倡將農業防治、生物防治和化學防治相結合的綜合防控措施，但大面積推廣受到抗病品種少、易復發、勞動力投入成本高等因素的限制[3]。長期以來，抗病育種是有效防控該病害最長久、高效、環保的措施之一，而鑒定抗病基因可以加快抗病育種進程。

細胞壁相關類受體激酶（Wall-associated kinases， WAK）是植物的類受體激酶（ Receptor-like kinases， RLKs）中一類重要的亞家族，N末端存在類表皮生長因子型（epidermal growth factorlike， EGF）結構域[4]。WAK部分成員與細胞壁中的果膠共價結合，在激發植物免疫反應中起重要的調控作用[5]。擬南芥基因組包括5個WAK基因（ WAK1～? WAK5），? AtWAK1是第一個被鑒定的植物WAK，可識別寡聚半乳糖苷，進而激活防御反應[6]。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）可增加海島棉? GbWAK3的轉錄，從而提高棉花對黃萎病菌的抗性[7]。此后，在水稻和煙草中都發現WAK家族基因的同源基因，其激活免疫反應并參與寄主對多種病原物抗性的調控[8]。

當植物激活免疫反應時，會產生活性氧（Reactive oxygen species， ROS）、激活有絲分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase， MAPK）級聯、細胞壁上的胼胝質（Callose）沉積以及免疫相關基因的轉錄[9]。茉莉酸（Jasmonic acid， JA）和水楊酸（Salicylic acid， SA）作為植物中與防御有關的重要信號分子，在病原體侵染時，植物細胞中JA和SA水平的增加，從而誘導相關抗病基因轉錄[10]。由輔因子 NPR1（Nonexpressor of? pathogenesis related genes 1）調節的系統獲得抗性（Systemic acquired resistance， SAR）由病菌局部侵染激活，在受侵部位產生系統信號，轉運到未受侵部位，激活防衛反應，從而產生對多種病菌的抗病反應[11]。在植物觸發免疫反應時，與免疫相關的標記基因（亦稱為Marker基因）的表達量顯著升高。因此，分析不同代謝通路Marker基因可快速、方便地檢測是否激發抗性反應。

山荊子（Malus baccata）是北方蘋果產區廣泛應用的砧木之一，對多種生物和非生物脅迫具有較強適應能力，對腐爛病亦具較強抗性[12]。前期工作中，結合轉錄組學分析，鑒定出一個可能調控腐爛病抗性的基因? MbLRK10L1.1?；诖?，本研究結合生物信息學分析、瞬時表達驗證及標記基因（Marker基因）表達分析等多種技術手段，以期明確? MbLRK10L1.1對腐爛病抗性的作用及可能的作用機制，為抗病基因的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病菌、材料及細胞系 腐爛病菌（Valsa mali，Vm）菌株Vm-A-019分離自甘肅靜寧發病‘富士蘋果樹韌皮組織，經單孢分離獲得，對‘長富2號具有強致病力，經ITS序列測定確定為Vm。東北山荊子組織材料由國家果樹種質興城蘋果圃提供，其懸浮細胞通過幼嫩葉片誘導后懸浮培養獲得，經多次繼代后，細胞松散、顏色淡黃、活力良好且狀態穩定。生長培養基（MS）為M519（PhytoTech Labs，美國）。

1.1.2 菌株、載體和試劑 大腸桿菌感受態TreliefTM 5SymbolaA@購買自擎科生物科技有限公司（北京），農桿菌感受態GV3101，克隆載體pMDTM19-T均購買自TaKaRa（北京）。表達載體pFGC5941與pBI121均保存于甘肅農業大學園藝學院果樹分子生物學實驗室。柱式植物RNA out（含DNA酶）試劑盒購買自天恩澤基因科技有限公司（北京）。Evo M-MLV RT-PCR試劑盒、LA-Taq酶、Evo-M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ、SYBR Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒、Steady Pure質粒DNA提取試劑盒、Steady Pure DNA凝膠回收試劑盒、DNA連接試劑盒均購自艾科瑞生物科技有限公司（湖南）。核酸內切酶AscⅠ和AvrⅡ購自Thermo scientific公司（美國）。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物信息學分析 山荊子和蘋果WAKs的CDS和蛋白序列均下載自薔薇科基因組在線數據庫GDR（Genome Database of Rosaceae species， GDR; https：//www.rosaceae.org/species/malus/all）。擬南芥WAKs蛋白序列下載自擬南芥在線數據資源庫（Arabidopsis? information resource， TAIR; http：//www.arabidopsis.org）。利用Clustal X軟件進行多序列比對，并用進化分析軟件MEGA5.0 （http：//www.megasoftware.net/），以鄰接法（Neighb or-joining method）構建進化樹，執行參數為p-distance模式（p-distance）、部分刪除（Partical deletion）、有根樹設置1 000次重復（Bootstrap replicated?? 1 000）。 MbLRK10L1.1的結構域組成、理化性質和亞細胞定位預測分析分別利用在線軟件SMART（http：//smart.emblheidelberg.de/）、ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/）和WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）進行。啟動子區域（起始密碼子上游3 000 bp）的順式作用元件（cis-element）在PlantCARE數據庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）中分析。

1.2.2 蘋果腐爛病代謝物收集及細胞處理 將Vm-A-019菌株接種至PDA（Potato? dextrose agar）培養基，活化培養72 h后，取10個菌餅接種至100 mL PDB（Potato dextrose broth）培養基，黑暗、靜置培養72 h（每隔12 h震蕩1次），經離心和過濾除菌，獲得菌株代謝物原液。利用40目細胞過濾篩收集小的東北山荊子細胞團，并將500? μL細胞（密實體積）轉入至16 mL MS液體培養基，25? ℃、130 r/min搖床黑暗培養。培養? 48 h后，加入4 mL 菌株代謝物（VmM），分別于0、1、3 和6 h后收集懸浮細胞，速凍后-80 ℃保存，備用。

1.2.3 基因克隆和載體構建 利用軟件Primer Premier 5設計 MbLRK10L1.1全長序列擴增的引物（1.1F：5′-CTGGCGCGCCATGCCTACCCATTTTCTCCTAAAAC-3′；1.1 R：5′- TCCCTAGGTTACGGCGGAGAACGAATAAGT- TTAC- 3′），送至通用生物股份有限公司（安徽）合成。利用柱式植物RNA out（含DNA酶）試劑盒提取山荊子懸浮細胞的總RNA，經Evo M-MLV RT-PCR試劑盒反轉錄合成cDNA。以該cDNA為模板，利用LA-Taq酶進行PCR擴增。反應體系如下：cDNA模板1?? μL；LA-Taq酶 10? μL；上下游引物（均為10? μmol/L）各1? μL；加水至總體積20? μL。PCR反應產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物回收步驟參考Steady Pure DNA凝膠回收試劑盒。將上述膠回收的片段連接到pMDTM19-T載體上，連接產物轉化大腸桿菌感受態TreliefTM 5α。挑取陽性克隆于? 1 mL? LB培養基中[含氨芐青霉素（Amp），100 mg/L]，? 37 ℃，180 r/min搖床培養12 h?；罨蟮木核椭辽虾Ｉど锕こ逃邢薰緶y序。將堿基無錯配的菌液擴繁后用Steady Pure質粒DNA提取試劑盒提取質粒，經AscⅠ與Avr Ⅱ酶切獲得 MbLRK10L1.1基因片段。參考DNA連接試劑盒將酶切后的? MbLRK10L1.1基因片段與表達載體pFGC5941進行連接，獲得重組質粒（pFGC5941- MbLRK10L1.1）后進一步轉化農桿菌GV3101，涂布于LB固體培養基上[含卡納青霉素（Kana）100 mg/L，利福平（Rif）37.5?? mg/L]，28 ℃培養箱倒置培養48 h后挑取陽性克隆，經PCR驗證獲得陽性單克隆農桿菌，擴繁后-20 ℃保存，備用。

1.2.4 果實瞬時表達分析 將分別攜帶pFGC5941- MbLRK10L1.1、pFGC5941和pBI121的農桿菌菌株活化后，利用農桿菌滲入法在‘煙富6號果實（花后180 d）瞬時表達，方法參考Mao等[13]的報道。將活化后的農桿菌菌株用MES-KOH重懸，于4? ℃靜置4 h，用1次性無菌針頭吸取0.2 mL菌液注射進蘋果果實，25? ℃培養3 d后用GUS染色液（索萊寶，北京）對注射pBI121菌液的果肉進行染色。當果肉呈現藍色，表明基因成功瞬時表達。之后在注射菌液的部位接種已活化的Vm，于25 ℃的培養箱中繼續暗培養，每隔12 h測量1次果實病斑。同時，于Vm處理0、3、6和12 h時收集接種部位的果肉樣品，速凍后-80 ℃保存，用于Marker基因的表達模式分析。以上試驗設3次生物學重復。

1.2.5 基因表達分析 利用柱式植物RNA out（含DNA酶）試劑盒（北京）提取各樣品總RNA，經凝膠電泳質量檢測合格后利用的Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ（湖南）合成用于RT-qPCR的cDNA。利用在線軟件Primer 3.0（http：∥primer3.ut.ee/）設計引物，Actin引物采用Zuo等[14]的報道，抗性反應相關Marker基因引物參考孫娥等[15]的報道（表1）。

1.2.6 統計分析 原始數據處理采用Microsoft Excel 2010軟件，利用2-△△CT計算基因的相對表達量，利用t-test（P<0.05）分析差異顯著性，將處理好的數據利用OriginPro 8.0進行圖形可? 視化。

2 結果與分析

2.1? MbLRK10L1.1生物信息學分析

對 MbLRK10L1.1的基本參數分析表明，其氨基酸序列大小為660、分子質量為74.92 ku、理論等電點為5.42、位于質膜。結構域預測分析顯示，? MbLRK10L1.1具有WAK_assoc胞外結構域，完整的跨膜區和S_TKC激酶結構域，為WAK亞家族成員（圖1-A）。利用山荊子、蘋果和擬南芥中WAKs的蛋白序列構建進化樹，發現 MbLRK10L1.1（基因ID：MABA023866）與蘋果 MD14G1228700、 MD06G1218900，擬南芥 ATLRK10L1.1（基因ID：AT1G18390）親緣關系最近，命名為 MbLRK10L1.1（圖1-B）。對MbLRK10L1.1、MD14G1228700、MD06G1218900和ATLRK10L1.1的蛋白序列進行比對發現，MbLRK10L1.1與MD14G1228700、MD06G1218900、ATLRK10L1.1的序列相似度分別為94.82%、64.17%、43.72%（圖1-C）。說明 MD14G1228700是 MbLRK10L1.1在蘋果中的同源基因， ATLRK10L1.1是 MbLRK10L1.1在擬南芥中同源基因。 ATLRK10L1.1是編碼擬南芥葉銹病10號抗病位點受體樣蛋白激酶基因[16]，但 MbLRK10L1.1與? ATLRK10L1.1序列相似度較低，推測? MbLRK10L1.1可能存在不同功能。

2.2 MbLRK10L1.1上游啟動子區域存在響應逆境信號的順式作用元件

為進一步研究? MbLRK10L1.1的功能，分析了其啟動子區域（基因上游3 000 bp）存在的順式作用元件（cis-element）。如表2所示，在該基因啟動子區域含有較多的cis-element，包括9個響應脫落酸（ABA）元件、4個響應茉莉酸甲酯（MeJA）元件、2個厭氧誘導元件、2個參與玉米醇溶蛋白（Zein）代謝調節元件和17個參與光照響應元件。

2.3 MbLRK10L1.1組織特異性分析

為研究? MbLRK10L1.1在山荊子不同組織中的表達模式，通過RT-qPCR分析該基因在不同組織中的表達模式（圖2）。結果表明， MbLRK10L1.1在根組織中的表達量最高，為各組織表達量平均值的6.6倍，其次為1 a生枝，略高于平均值，在2 a生枝、老根和功能葉中的表達量最低。

2.4? MbLRK10L1.1響應腐爛病信號的表達分析

從前期轉錄組數據中提取? MbLRK10L1.1在山荊子懸浮細胞響應腐爛病代謝物（VmM）前后的表達數據[17]。對照細胞中，該基因的FPKM（Fragments? per? kilobase of exon model per? million mapped fragments）值為211，處理1、3和6 h后，分別上調至398、416和433（圖3-A）。利用RT-qPCR分析相同條件下該基因的表達模式，發現該基因在響應VmM過程中顯著上調表達。在處理1、3和6 h后分別上調表達至對照的3.2、? 2.7和3.1倍（圖3-B）。表明? MbLRK10L1.1可能參與VmM信號的響應。

2.5 載體構建及農桿菌轉化

以山荊子總RNA反轉錄合成的cDNA為模板，加入? MbLRK10L1.1基因特異性引物和LA-Taq酶，經 PCR擴增后得到產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段大小約為2 049 bp（圖4-A），與目的基因片段大小一致。將上述PCR產物回收后與pMDTM19-T連接，經酶切（圖4-B）和測序雙重驗證后，回收雙酶切目的片段并構建重組質粒pFGC5941-MbLRK10L1.1，轉化農桿菌GV3101，得陽性克?。▓D4-C），大小為? 2 049 bp與預期相符，表明成功將? MbLRK10L1.1轉入農桿菌。

2.6 果實瞬時表達

2.6.1 果實瞬時表達MbLRK10L1.1基因的表達量 果實中分別注射攜帶重組質粒（pFGC5941- MbLRK10L1.1）、空載體pFGC5941和pBI121的農桿菌。于注射72 h后，注射攜帶pBI121載體的農桿菌的果實可成功被GUS染色液標記至藍色，表明在該條件下GUS基因成功表達（圖5-A）。此后，用RT-qPCR測定各處理果實中目標基因的表達量，發現注射攜帶重組質粒農桿菌的果實中? MbLRK10L1.1的表達量上升至對照（pFGC5941）的17倍（圖5-B），表明 MbLRK10L1.1在果實中成功瞬時表達。

2.6.2?? MbLRK10L1.1正調控蘋果腐爛病 為驗證? MbLRK10L1.1對蘋果腐爛病的調控作用，在注射部位分別接種Vm，于不同時間點統計病斑直徑。接種24 h時，? MbLRK10L1.1對Vm的調控作用不顯著，此后 MbLRK10L1.1瞬時表達果實的病斑直徑小于對照果實。接種36、48、60、72和84 h時，瞬時表達果實的病斑直徑分別為8.2、9.8、11.3、13.4、18.5 mm，而對照的則分別為8.9、11.6、14.3、17.5、21.6 mm（圖6-C）。于接種72 h拍照記錄， MbLRK10L1.1瞬時表達部位的病斑（圖6-B）顯著小于對照部位（pFGC5941）（圖6-A）。以上結果表明， MbLRK10L1.1瞬時表達增強了蘋果果實對腐爛病的抗性。

2.7 果實瞬時表達后相關通路Marker基因表達量的測定

為進一步了解? MbLRK10L1.1調控腐爛病的機制，使用RT-qPCR檢測抗性相關通路Marker基因的表達模式。如圖7所示，與對照果實相比，接種Vm后，瞬時表達? MbLRK10L1.1果實中參與PTI、ROS、R蛋白、SA、SAR和JA信號通路的Marker基因? FRK1（Flg22-induced receptor-like kinase 1）、TaNOX （Triticum aestivum NADPH oxidase）、? EDS1（Enhanced disease susceptibility 1）、 PR4（Pathogenesis-Related 4）、 CHN50（LOC107826794）和 LOX1（Lipoxygenase 1）的表達量都呈現不同程度的上調。其中， LOX1（圖7-F）的上調表達最為明顯，在Vm處理6和12 h時，分別上調至對照的1.7和4.6倍。其次?? PR4（圖7-D）和? CHN50（圖7-E）在Vm處理6和12 h時，分別上調至對照的1.5、3.5倍以及1.4、3.4倍。此外，? FRK1（圖7-A）、TaNOX（圖7-B）和? EDS1（圖7-C）均在Vm處理12 h明顯上調，分別上調至對照的1.7、2.1和2.2倍。以上結果表明， MbLRK10L1.1瞬時表達后可激活PTI、ROS、R蛋白、SA、SAR和JA等多種抗性相關的信號通路。

3 討論與結論

WAKs在植物中的表達會受到生物和非生物脅迫的影響，并參與細胞伸長及對鹽堿、重金屬和病原菌等多種逆境信號響應[18]。在擬南芥、水稻和番茄等模式植物中研究較為廣泛。例如： OsWAK1與胞壁相關聯，受稻瘟病誘導表達，并且受水楊酸、茉莉酸的誘導[19]。番茄中 SlWAK1能加強植株對番茄假單胞桿菌抗性[20]。但WAKs在蘋果等非模式植物中研究較少。本試驗通過對前期轉錄組學分析，發現山荊子WAK家族成員? MbLRK10L1.1能響應腐爛病信號，并結合生物信息學分析，果實瞬時表達以及RT-qPCR等技術，初步研究? MbLRK10L1.1在Vm處理后的抗病機制。

病原微生物侵害初期，位于細胞膜上的模式識別受體（Pattern recognition receptors，PRRs）通過識別外源病原物/損傷相關分子模式（Pathogen/damage-associated molecular pattern， PAMP/DAMP）而觸發基礎免疫反應，也稱PAMP觸發的免疫反應（PAMP-triggered immunity，PTI）[21]。? EDS1作為一種重要的防衛基因，在植物觸發PTI反應中發揮重要作用，可調控細胞內活性氧爆發、SA和JA通路的信號傳導[22]。? FRK1作用于MPK3（Mitogen-activated protein kinases 3 ）的下游，在PAMP/DAMP處理后的早期時間點被誘導[23]。在植物PTI反應初期，植物體內的ROS含量升高，NADPH氧化酶（NADPH oxidase， NOX）作為植物ROS產生的關鍵酶之一，其家族成員的轉錄增加，在植物抗逆響應中發揮重要作用[24]。在本試驗中，瞬時表達? MbLRK10L1.1可以一定程度上激活? EDS1、? FRK1以及TaNOX的表達，表明? MbLRK10L1.1可以通過激活植物的PTI反應抵御腐爛病菌的? 侵染。

SA和JA在植物防御中起著極其重要的作用，是植物防御反應中重要的信號分子，但二者存在不同的機制。目前已經在許多植物中發現JA和SA之間存在相互拮抗作用。研究表明，SA信號途徑主要調控植物抵御寄生菌的侵染，JA信號途徑則主要介導腐生菌的侵染[25]。苯內氨酸轉氨酶（Phenylalaninammo-nialyase，PAL）是SA合成過程中的關鍵酶之一，在煙草中過量表達PAL后植株體內SA含量升高的同時JA含量卻下降[26]。JA信號通路也能夠抑制SA信號通路。在臭氧誘導的細胞死亡過程中，JA能通過抑制SA的生物合成從而減弱由SA引起的細胞死亡[27]。但當SA和JA的濃度不同，這種拮抗作用也會轉變為協同作用，例如：對煙草幼苗施加SA和JA的混合液后，誘導的SA相關基因的表達量會比單獨施加SA的高[28]。本試驗表明，在Vm處理后，? MbLRK10L1.1既能激活JA信號通路基因的表達，也能激活SA信號通路基因的表達。表明? MbLRK10L1.1可通過參與JA和SA通路的信號轉導抵御腐爛病的侵染。

綜上，在Vm處理下能激活 MbLRK10L1.1的表達，并且瞬時表達? MbLRK10L1.1能增強蘋果果實對腐爛病的抵抗，同時也激活PTI、JA和SA等相關抗性通路。

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Gene? MbLRK10L1.1 Positively Regulates Valsa Canker? in Malus baccata

Abstract Valsa canker? caused by Valsa mali （Vm） is a prevalent fungal disease affecting the apple industry.Wall-associated kinases （WAKs） play an important role in cell proliferation，growth and development，pathogen resistance and other physiological responses in plants.In the previous work，we?? identified the WAK genes， MbLRK10L1.1，from Malus baccata，which is potentially associated with the response to Vm infection.On this basis，this study integrated bioinformatics analysis，expression?? analysis and functional validation to elucidate the molecular mechanism underlying the involvement of?? MbLRK10L1.1? in the response to Vm.The results showed that? MbLRK10L1.1 responded to the Vm signaling，and overexpression of? MbLRK10L1.1? significantly reduced the rate of lesion spread on the fruit surface.The upregulation of disease resistance-related genes such as? FRK1（Flg22-induced Receptor-like Kinase 1），TaNOX （Triticum aestivum NADPH Oxidase），? EDS1（Enhanced Disease Susceptibility 1） and others were observed.The above results indicated that the gene （ MbLRK10L1.1） could positively regulate the resistance of apple to the Valsa? canker through JA，SA，SAR，and PTI pathways.

Key words Valsa canker; WAK gene; Transient expression; Marker gene