百合萜烯合成相關基因LiGGPPS大小亞基基因的克隆、表達及功能分析

劉旭平 王浩楠 張茜 冷平生 胡增輝

摘 要 香葉基香葉基焦磷酸合酶（GGPPS）是調節萜類化合物生物合成的關鍵酶，為了研究GGPPS基因在百合萜類物質合成中的作用，本試驗以‘西伯利亞百合（Lilium ‘Siberia）為試材，克隆了GGPPS大亞基（LiGGPPS.LSU）和小亞基（LiGGPPS.SSU）基因，并分析其表達和功能。通過生物信息學分析、相對表達量分析、熒光定量PCR、亞細胞定位、基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）預測并驗證其特征及功能，揭示其表達模式。結果表明，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分別為1 100 bp和1 040 bp，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU的氨基酸序列與其他物種的GGPPS.LSU和GGPPS.SSU的氨基酸序列具有較高的一致性，系統進化樹顯示它們分別與薯蕷（Dioscorea cayenensis subsp. rotundata）和深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）親緣關系最近。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因均定位在葉綠體中，表達量隨百合的生長發育呈現先上升后下降的趨勢。LiGGPPS.LSU在花被片中高量表達，LiGGPPS.SSU在花藥中顯著高量表達。VIGS試驗顯示芳樟醇、羅勒烯、月桂烯釋放量下降。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因對百合花香單萜類物質合成具有重要作用，本試驗為進一步研究百合GGPPS以及相關代謝途徑提供理論基礎。

關鍵詞? ‘西伯利亞百合；GGPPS；萜烯化合物；基因克隆；表達分析

釋放花香是開花植物的重要特性［1］。花香在吸引傳粉者［2-3］和抵御病蟲害［4-5］等方面具有重要作用。花香也是花卉重要的觀賞性狀，對于提升花卉的觀賞和經濟價值具有重要作用。花香物質由一系列低分子量揮發性有機化合物組成，包括萜烯類、苯環類/苯丙烷類、脂肪族類、含硫化合物和含氮化合物等 ［6］。萜烯化合物是植物產生的眾多化合物中最大的一類，如芳樟醇、羅勒烯和月桂烯等［7］，是許多植物花香的主要成分，揭示其合成機制對于進一步了解其功能，進而進行調控奠定基礎。

目前已經清楚，萜烯化合物源自異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）和它的同分異構體二甲基烯丙基焦磷酸 （dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP），二者可通過位于質體的甲基赤蘚糖醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑和胞質中甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑合成［8］。這兩種途徑的類異戊二烯通量在多個層面受到嚴格調控，除受通路基因及其并行同源基因的轉錄調控，還受轉錄后/翻譯水平和反饋調節的控制［9］。香葉基香葉基焦磷酸合酶（farnesyl/geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS）處于途徑下游，能夠催化1分子DMAPP和3分子IPP通過3個連續的縮合步驟形成GGPP ［10］。GGPPS負責類胡蘿卜素等的生物合成［11］，參與催化蛋白的異戊二烯化［12］，同時也是控制植物代謝中“碳流”方向的類異戊二烯化合物［13］。植物中已經發現了同源和異源二聚體兩種類型的GGPPS，異源二聚體GGPPS由一個非活性小亞基（SSU）和一個大亞基（LSU）組成［14］。SSU自身不具有催化活性，不能通過形成同源二聚體催化反應，但能夠與LSU或GPPS互相作用，調節后者發揮生物學功能，改變GGPP和GPP生物合成的比例［15］。目前，已在芒果（Mangifera indica）［16］、竹葉花椒（Zanthoxylum armatum）［17］、山雞椒（Litsea cubeba）［18］、茉莉花（Jasminum sambac）［19］、梔子（Gardenia jasminoides）［20］等植物中發現GGPPS基因對萜烯合成具有重要作用，但GGPPS大亞基和小亞基基因在百合中尚未被克隆，在百合花香萜烯合成中的作用還不清楚。

萜烯是植物花香的主要成分［21］，也是多種百合花香的關鍵成分。由于在長期育種過程中忽視花香［22］，造成不同品種百合間花香存在顯著差異，有些百合香氣過濃，有些過淡［23］，均影響其觀賞和應用價值，因此改造花香，培育花香怡人的新品種是百合育種的熱點方向。萜烯化合物的差異釋放被認為是造成百合花香差異的主要原因［24］，因此，查清萜烯合成調控機制是開展百合花香定向育種的基礎和依據。

本研究以東方百合‘西伯利亞（Lilium ‘Siberia）為材料，克隆LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因，通過生物信息學分析、相對表達量分析、熒光定量PCR、亞細胞定位、VIGS功能驗證以及蛋白的互作分析，預測并驗證其特征及功能，揭示其表達模式，為揭示LiGGPPS基因大亞基和小亞基在‘西伯利亞百合單萜物質合成中的作用和功能奠定基礎，為開展百合花香育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為‘西伯利亞百合實生苗（種球購自北京荷景良苑貿易有限公司），以盆播的方式種植于北京農學院單坡面溫室大棚（40° 5′24″N， 116° 17′55″E）中，栽培基質中草炭土與蛭石的體積比為2∶1，給予適當的田間養護。

選取生長狀態良好、無病蟲害、均高1 m的植株，采集花蕾期、初開期、半開期、盛開期和衰敗期的花被片和盛開期百合的根、莖、葉、外花被片、內花被片、子房、花藥、花柱和花絲，經液氮速凍后迅速轉移至-80 ℃超低溫冰箱保存。每組樣品設3次生物學重復。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取與反轉錄 使用RNA提取盒TransZol Up Plus RNA Kit（全式金，ET111- 01）分別提取5個花期的‘西伯利亞百合花被片和盛開期百合各組織的RNA，電泳后檢測該RNA的質量及濃度，使用反轉錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金，AT311-02）將樣品RNA反轉錄成cDNA。

1.2.2 基因全長克隆 通過3代轉錄組數據篩選出LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因。使用SnapGene軟件設計全長擴增引物（表1），以反轉錄得到的cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR反應體系為：FastHiFi PCR MasterMix?? 12.5 μL，cDNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應的條件為：98 ℃預變性 3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火? 30 s，72 ℃延伸1 min，共33個循環。然后對產物進行純化回收、連接轉化、測序鑒定及比對分析。

1.2.3 生物信息學分析 使用NCBI在線軟件CD-Search進行基因保守結構域檢索，通過BLAST軟件進行序列比對，從檢索結果中隨機下載若干序列。使用MEGA11軟件中的Muscle算法進行多序列比對，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統進化樹，步長檢驗（Bootstrap Replication）1 000次。使用WoLF PSORT在線軟件（https：∥wolfpsort.hgc.jp/）預測亞細胞定位。

1.2.4 相對表達量分析 根據克隆得到的LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因，使用Primer Primier軟件設計熒光擴增引物（表1），將9.5 μL ddH2O、1 μL Forward GSP、1 μL Reverse GSP、1 μL cDNA、12.5 μL 2× SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Takara，RR420A）注入八聯排管各孔中，進行qRT-PCR分析。根據相對表達量公式2-ΔΔCt計算基因的相對表達量，分析顯著性差異并作圖。

1.2.5 VIGS功能驗證 選取LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU基因開放閱讀框200 bp序列插入到酶切后的pTRV2載體中，設計引物LiTGGPPS.LSU-F/R和LiTGGPPS.LSU-F/R（表1）對目的基因片段進行同源克隆。利用同源重組法構建pNCTRV2-LiGGPPS.LSU和pNCTRV2-LiGGPPS.SSU沉默載體，轉化到農桿菌感受態GV3101細胞中。挑取轉化單菌落到Kan+和Rif+液體培養基中，菌液PCR檢測陽性轉化菌株。制備農桿菌VIGS菌液，采用注射法侵染‘西伯利亞百合花被片，同時以注射空載體pNC-TRV2菌液的植株和WT作為對照組。將處理后的植株于20 ℃培養間遮光處理12 h后轉為正常光照，培養7 d后進行實時熒光定量PCR。采用固相微萃取方法采集花香物質，通過GC-MS聯用技術測定花香釋放量，使用MSD Productivity ChemStation的NIST14鑒定揮發物的成分［25］，使用Excel 2020統計數據。

2 結果與分析

2.1 基因克隆

如圖 1所示，克隆得到的LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU片段分別為1 100 bp和? 1 040 bp。經切膠回收，連接轉化，測序比對，確定目的基因的最終序列。

2.2 生物信息學分析

經序列比對（圖2），LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU與其他物種的GGPPS.LSU和GGPPS.SSU序列具有較高一致性，可能具有相似的功能。系統進化樹（圖3）顯示LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分別與薯蕷（Dioscorea cayenensis subsp. rotundata）和深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）親緣關系較近。

2.3 花期表達特性分析

如圖4所示，LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU在‘西伯利亞百合5個不同花期中的表達量具有顯著性差異（P<0.05），隨著百合的生長發育，呈現先上升后下降的趨勢。LiGGPPS.LSU的表達量在初開期達到峰值，在衰敗期的表達量最低；LiGGPPS.SSU的表達量在盛開期達到峰值，在花蕾期的表達量最低。LiGGPPS.LSU在初開期和半開期的表達量相近；LiGGPPS.SSU在初開期、半開期和衰敗期的表達量相近，是花蕾期表達量的3倍。

2.4 組織表達特性分析

如圖5所示，LiGGPPS.LSU在花被片中高量表達，LiGGPPS.SSU在花藥中顯著高量表達，在葉片和子房的表達量均最低。

2.5 VIGS功能驗證

圖6-A顯示，沉默株系中LiGGPPS.LSU和GGPPS.SSU基因表達量顯著降低，沉默效率為89%和85%。圖6-B顯示，與對照組（pNC-TRV2侵染的花瓣和野生型正常生長的花瓣WT）相比，發病植株花被片單萜釋放量大幅下降。基因沉默后，單萜物質芳樟醇、羅勒烯、月桂烯較WT相比，分別下降了12.3、14和8.3倍和20、17.7和5倍。

3 討? 論

萜烯化合物是植物花香的主要成分，也是多種百合花香的關鍵成分。GGPPS家族中有部分同源基因對萜類代謝起著關鍵的調控作用，能顯著影響植物體內萜類化合物的合成［18］。但GGPPS基因大亞基和小亞基在百合中尚未被克隆，本試驗利用‘西伯利亞百合克隆LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU分別為1 100 bp和1 040 bp。LiGGPPS.LSU的表達量在初開期達到峰值，然后逐漸減小，于花被片中高量表達；LiGGPPS.SSU在盛開期表達量最高，在花藥中表達量? 顯著。

‘西伯利亞百合MEP途徑上游合成酶基因LiDXS與LiDXR在葉綠體中特異表達，在盛開期高量表達，在花被片中表達量顯著［26］。單萜合酶基因LiTPS基因在花被片中高量表達，在盛開期表達量最高［27］。LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU與LiDXS、LiDXR、LiTPS存在于同一個通路中，且基因時空表達具有相同的特征，說明LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU可能在單萜合成中發揮重要作用。通過VIGS試驗發現，發病植株花被片單萜釋放量及其相關合成基因的表達量均顯著下降，證明LiGGPPS.LSU和LiGGPPS.SSU在單萜合成中具有重要作用。

水稻GGPPS的二聚狀態由GGPPS融合蛋白（GRP）控制，OsGGPPS1與OsGRP聚合形成的異源二聚體比OsGGPPS1同源二聚體的催化效率更高，說明它可能通過決定OsGGPPS1在葉綠體中的分配，影響GGPP向下游途徑的代謝流量［28］。對胡椒薄荷（Mentha piperita）和仙女扇（Clarkia breweri）的研究說明SSU和LSU/GGPPS的結合可以增強異源二聚體的GPPS催化特性［29］。啤酒花 （Humulus lupulus）中，SSU與HlGPPS.LSU形成異源二聚體，產生GPP和GGPP，且酶活性顯著高于? HlGPPS.LSU自身催化效率［30］。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，AtGGPPS.LSU和AtGGPPS.SSU共同參與了單萜的生物合成［31］。在金魚草（Antirrhinum majus）中，單獨不具有活性的GGPPS.SSU在體內可以和GGPPS.LSU以疏水作用結合形成異源二聚體調節GGPPS.LSU的活性［32］。煙草（Nicotiana tabacum）GGPPS.LSU能夠形成同源二聚體，催化GGPP的合成。但與AmSSU I結合后，轉基因煙草中單萜類物質含量增加［33］。

4 結? 論

GGPPS.LSU和GGPPS.SSU是萜類化合物合成中重要的結構基因，可能共同參與了MEP途徑中烯萜化合物的合成，對于調控‘西伯利亞百合花香物質合成具有重要的作用。本研究對深入揭示百合萜類合成的分子機制有重要作用，為進一步研究植物中GGPPS以及相關代謝途徑提供理論基礎，也為今后利用轉基因技術調控植物萜烯化合物合成提供了研究思路。

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Cloning， Expression and Functional Analysis of LiGGPPS.LSU? and LiGGPPS.SSU Involved in Flower Fragrance Synthesis in Lilium

Abstract Geranylgeranyl pyrophosphate synthase（GGPPS） is a crutial enzyme that regulats terpenoid biosynthesis in plants. To investigate the role of GGPPS genes in lily terpenoid synthesis， we cloned LiGGPPS. LSU and LiGGPPS.SSU genes and analyzed their expression and function using ‘Siberian lily as test material. Bioinformatics analysis， relative expression analysis， fluorescence quantitative PCR， subcellular localization， VIGS（virus induced gene silencing） and yeast two-hybrid were used to predict and verify their characteristics and functions， and to reveal their expression patterns. Results showed that LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU were 1 100 bp and 1 040 bp，respectively， with the amino acid sequences that?? had high similarity with those of other species.Phylogenetic analysis showed that LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU had the closest relationship with DcGGPPS.LSU and AsGGPPS.SSU in Dioscorea cayenensis subsp.rotundata? and Apostasia shenzhenica. Both LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU were localized in the chloroplasts， and their expression showed an rising trend， followed by declining trend as the flower grew and developed. LiGGPPS.LSU was highly expressed in the tepals，while LiGGPPS.SSU was highly expressed in the anthers. The VIGS assay showed a decrease in the release of linalool， basilene and lauricene. The findings suggest that LiGGPPS.LSU and LiGGPPS.SSU genes play an important role in the synthesis of monoterpenes in lily flowers，providing a theoretical basis for further research on LiGGPPS and related metabolic pathways.

Key words? Lilium ‘Siberia; GGPPS; Terpene compounds; Gene cloning; Expression analysis