超高效液相色譜法檢測大豆異黃酮含量

◎ 靳 穎

（黃河交通學院，河南 焦作 454950）

大豆異黃酮（CatheRine Genistein）是黃酮類化合物的一種，它作為一種次生代謝產物，形成于大豆植物體生長過程。大豆異黃酮結構與雌激素相似，因此又稱植物雌激素[1]。大豆異黃酮不僅具有明顯的抗氧化作用，而且還可以起到預防骨質疏松、多種癌癥、心血管疾病等功效[2]。大豆異黃酮母核為3-苯并吡喃酮，以游離型的苷元和結合型的糖苷形式存在[3]。糖苷占大豆異黃酮總量的97%～98%，苷元僅占大豆異黃酮總量的2%～3%。糖苷主要有大豆苷（daidzin）、料木苷（genistin），苷元主要有染料木素（genistein）、大豆苷元（daidzein）[4]。目前，紫外吸收法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[5-7]是大豆異黃酮的主要檢測方法。其中，紫外吸收法靈敏度不高，只能測定大豆異黃酮總量。氣相色譜法前處理復雜，需要對異黃酮進行衍生。高效液相色譜法具有樣品分離度好、定量準確、操作容易、處理簡單等優點[6]。因此，本文建立一種超高效液相色譜法，用于測定大豆中大豆異黃酮含量，以提供一種快速簡便、靈敏度高的大豆異黃酮含量檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆（市購），粉碎備用。

大豆苷（daidzin）、大豆苷元（daidzein）、染料木素（genistein）、染料木苷（genistin）（純度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；甲醇、乙腈，Merck公司，為色譜純；乙酸，Merck 公司，為分析純；超純水，一級水。

1.2 儀器與設備

ACQUITY Ultra Performance LC 超高效液相色譜儀，Waters 公司；2998 Photodiode Array Detector 光電二極管陣列檢測器，Waters 公司；渦旋混合器，IKA公司；超聲波儀，寧波東和超聲波科技有限公司；恒溫干燥箱，上海宏泰儀器設備廠；高速離心機，HITACHI 公司；分析天平，OHAUS 公司；PURELAB Chorus 超純水機，ELGA 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準工作液配制

標準儲備液：用分析天平準確稱取大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷0.01 g，置于100 mL 容量瓶中，加入70%甲醇溶解，并定容至刻度，制成0.1 mg·mL-1標準儲備液。

標準工作液：臨用時，根據實際需要，對標準儲備液用進行適當的濃度稀釋，得到標準工作液，保存于冰箱中備用。

1.3.2 樣品處理

用分析天平準確稱取試樣10 g，精確到0.01 g，將試樣置于100 mL 離心管中。加入70%甲醇定容，渦旋混合60 s，超聲波儀中振蕩20 min，然后放入離心機內，在離心機中以9 000 r·min-1離心5 min，取離心上清液，移至100 mL 容量瓶中。用0.45 μm 濾膜過濾，加入70%甲醇補至相應刻度。吸取10 mL 樣品，將其置于100 mL 離心管中，恒溫干燥箱濃縮至干，用乙腈-0.2%乙酸溶液將濃縮樣品定容至5 mL，再用0.45 μm 濾膜過濾，移至進樣瓶中。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEHC C18柱[8]（150 mm×2.1 mm，1.7 μm），進樣量為5 μL；流速為0.15 mL·min-1；經全波長掃描大豆異黃酮成分，并比較了不同波長的峰，結果發現，在260 nm 波長處靈敏度高，因此檢測波長選擇260 nm；大豆異黃酮的保留值和分離度都受柱溫的影響，為了避免柱溫較高，縮短保留時間，選擇30 ℃柱溫；由于大豆異黃酮極性較弱，為實現完全分離，通過研究乙腈和不同濃度的乙酸對大豆異黃酮成分保留值和分離度的影響，流動相選用乙腈-0.2%乙酸，梯度洗脫條件如表1所示。

表1 分離梯度程序表

2 結果與分析

2.1 線性關系及檢出限

吸取一定量的大豆異黃酮標準工作液，用甲醇水溶液將其稀釋成1.0 μg·mL-1、3.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、7.0 μg·mL-1、9.0 μg·mL-1以及0 μg·mL-1的溶液，經處理后進行測定，每個大豆異黃酮成分重復測定3 次。設定濃度為橫坐標X，大豆異黃酮成分3 次測定峰面積平均值為縱坐標Y，對其進行線性回歸，得到大豆異黃酮成分的標準曲線，如表2 所示。線性檢測范圍均為1.0 ～9.0 μg·mL-1。

表2 大豆異黃酮成分標準曲線表

2.2 精密度試驗

分別精密吸取同一標準工作液，連續平行進樣5 次，測定4 種大豆異黃酮成分的峰面積，如表3 所示。大豆苷的RSD 為0.28%，大豆苷元的RSD 為0.22%，染料木素的RSD 為0.32%，染料木苷的RSD 為0.26%，結果表明儀器精密度良好。

表3 大豆異黃酮成分精密度表

2.3 穩定性試驗

在樣品溶液中，加入標準工作液，每隔4 h 進一次樣，進樣6 次，測定4 種大豆異黃酮成分的峰面積，如表4 所示。大豆苷的RSD 為0.33%，大豆苷元的RSD 為0.25%，染料木素的RSD 為0.88%，染料木苷的RSD 為0.46%，結果表明，標準工作液在24 h 內穩定。

表4 大豆異黃酮成分穩定性表

2.4 回收率試驗

回收試驗時，在樣品溶液中，準確加入大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷的標準工作液，重復進樣5次，得到4種大豆異黃酮成分的回收率，如表5所示。結果表明，大豆苷回收率為97.6%，RSD 為1.8%；大豆苷元回收率為98.2%，RSD 為1.7%；染料木素回收率為98.6%，RSD為2.1%；染料木苷回收率為97.6%，RSD 為1.4%。

表5 大豆異黃酮成分回收率表

2.5 樣品測定

精確吸取樣品溶液5 μL，對大豆異黃酮含量進行檢測，計算得出大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷含量，具體如表6 所示。

表6 4 種大豆異黃酮含量表

3 結論

大豆異黃酮在我國藥品、保健品、食品等行業應用廣泛，為滿足日常大豆異黃酮檢測的需求。通過試驗建立了一種超高效液相色譜法檢測方法，用于測定大豆中大豆異黃酮的含量，該超高效液相色譜法采用BEHC C18色譜柱，能夠在較大的樣品流量下，保證色譜柱的柱效，實現快速分離，并保證峰形尖銳、對稱。線性關系、精密度、穩定性、回收率的試驗結果表明，將該超高效液相色譜法用于檢測大豆異黃酮的含量，可以提高檢測的靈敏度和穩定性。從樣品檢測結果得知，大豆中大豆異黃酮成分中，大豆苷含量最高，為352 μg ·g-1，大豆苷元含量最低，為19.5 μg·g-1。