一種可快速檢測大腸桿菌O157:H7 的紙基傳感器的制備與應用

◎ 王曉穎，施錦輝，王金娟，戴晗祎，郭驍駒，王曉惠

（1.南通海關綜合技術中心，江蘇 南通 226004；2.江南大學食品學院，江蘇 無錫 214122；3.南通市如皋生態環境監測站，江蘇 如皋 226500）

食源性致病菌是引發公共衛生安全事件的重要因素之一，其在食品的制造、銷售、處理和消費等過程中都有傳播的可能性[1]。在食源性致病菌中，大腸埃希氏菌是易導致出血性腹瀉和腸炎的致病菌，O157:H7 則是典型的菌屬，該致病菌通常存在于未經加工的蔬菜、肉制品中，若攝入被大腸桿菌O157:H7污染的食品，會對人體造成較大傷害[2]，因此需要建立一類適用于現場快速檢測的方法來對食品進行篩查，盡量減少致病菌帶來的危害。

大腸桿菌O157:H7 的檢測方法有傳統的培養法、分子生物學檢測、免疫學方法[3]、生物傳感器法和核酸適配體法等。傳統的檢測方法的檢測周期長、對檢測人員經驗要求高，免疫學和分子生物學檢測方法的操作復雜、無法滿足現場快速檢測的要求，因此如何在低成本、高效、快速的前提下進行檢測成為亟待解決的問題。本研究制備了一種基于適配體的快速檢測紙基傳感器，用于大腸桿菌O157:H7 的檢測。該傳感器有較好的特異性和重復性，可在15 min 內快速檢測出大腸桿菌O157:H7 并應用于實際樣品檢測中。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硝酸鎵；99.99%六水合硝酸鋅；硝酸鉻；氨水（28 wt%）；鹽酸；異丙醇；氫氧化鈉；超純水；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）；N-羥基丁二酰亞胺（NHS）；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）；無水乙醇；羥基化聚乙二醇羧酸（HO-PEG12-COOH）；PBS 緩沖液（0.01 mol·L-1，pH=7.4）；Tris-HCl 緩沖液（10 mmol·L-1，pH=7.2）；功能化核酸適配體及其互補序列；whatman1號定性濾紙；吸水棉；底板；大腸埃希氏菌O157:H7（ATCC35150）；麥氏比濁管；瓊脂平板。

1.2 儀器設備

CP-225D 天平，德國賽多利斯；便攜式pH 計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；XPDHG-9246A數顯鼓風干燥箱，上海析譜儀器有限公司；馬弗爐，英國CARBOLITE；DF-101S 集熱式磁力攪拌器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；Milliq Academic 超純水機，美國密理博公司；KQ-50E 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；水熱反應釜，力辰科技；TG-16 離心機，上海屹譜；Talos F200 透射電子顯微鏡，賽默飛；D8 ADVANCE X 射線衍射儀，布魯克AXS；RF-6000 熒光分光光度計，日本島津公司；Zeta 電位分析儀，PALS 美國布魯克公司；WFH-204B手提式紫外分析儀，杭州齊威儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 材料合成

本文采用一步水熱法[4]合成紅色長余輝納米材料ZnGa2O4:Cr3+，首先用超純水分別配制2 mol·L-1硝酸鎵、1 mol·L-1硝酸鋅、1 mmol·L-1硝酸鉻溶液，再移取1 mL 硝酸鎵、2 mL 硝酸鋅、4 mL 硝酸鉻的水溶液于燒杯中混合均勻，加超純水定容至30 mL，定容過程中用氨水調節溶液pH 至9.0。隨后，將混合溶液于室溫攪拌0.5 h 使其預反應，預反應結束后將溶液轉移到聚四氟乙烯內襯反應釜（內襯體積50 mL）中，封好后將反應釜放入220 ℃烘箱中（事先預熱），水熱反應約10 h。反應結束后，待反應釜自然冷卻到室溫，將產物分散于0.01 mol·L-1鹽酸中，充分混合后離心收集，加入過量異丙醇離心洗滌3 次，最后用超純水洗滌1 次，于真空干燥箱中干燥備用。

1.3.2 適配體選擇

參考文獻[5]合成修飾過的大腸桿菌O157:H7 適配體及DNA 互補鏈，用以修飾長余輝材料的適配體的5'端均修飾了羧基，3'端修飾了生物素，其余適配體5'端均用生物素進行了修飾，所有適配體和DNA 互補鏈均委托上海生工生物工程有限公司合成，所合成的DNA 序列見表1。

表1 適配體或DNA 序列表

1.3.3 適配體功能化材料

（1）羥基化修飾。將200 mg 紅色長余輝納米材料放入5 mmol·L-1氫氧化鈉溶液中并超聲分散，在室溫條件下攪拌24 h，而后放入離心機中2 700 r·min-1離心分離5 min，將離心產物依次用超純水（自制）洗滌3 次，洗滌所得產物于真空干燥箱中，在10-2Pa、50 ℃條件下干燥6 h，收集備用。

（2）氨基化修飾。取羥基化的紅色長余輝材料100 mg，超聲分散于40 mL DMF 中，邊磁力攪拌邊向溶液中加入APTES，加入量約為40 μL；滴加結束后將其置于80 ℃下恒溫攪拌12 h，2 700 r·min-1離心3 min，分離收集底部沉淀；用DMF 洗滌沉淀3 次，無水乙醇洗滌2 次，最終產物在室溫下真空干燥。

（3）適配體功能化長余輝納米探針。通過酰胺縮合反應實現長余輝納米顆粒與核酸適配體的偶聯。具體方法是將5 mg 氨基功能化的長余輝納米材料與4 nmol 的5'端修飾了COOH 和3'端修飾了生物素的大腸桿菌O157:H7 的適配體1、8 nmol 的NHS、16 nmol的EDC 混合于0.01 mol·L-1的PBS 溶液（pH 在7.4左右）中，室溫下避光攪拌。接著將4 μmol 的HO-PEG12-COOH、8 μmol的NHS、16 μmol的EDC加入上述溶液中，于室溫下避光攪拌反應8 h，3 000 r·min-1離心5 min以分離除去未反應的適配體，將沉淀用10 mmol·L-1Tris-HCl 緩沖液（pH=7.2）洗滌3 次即可得到適配體功能化的長余輝納米顆粒，再將其置于緩沖溶液中分散存儲備用。

（4）材料表征。將長余輝材料粉末置于X 射線衍射儀中掃描獲取XRD 圖譜，將長余輝材料極少量分散于水溶液中進行超聲，再放入熒光分光光度計測得激發光譜和發射光譜，將固體粉末和水溶液分別放于紫外燈254 nm 條件下照射，可觀察到熒光現象。將功能化修飾前后的長余輝材料分散于純水中，然后置于Zeta 電位分析儀中測得材料的電位變化。

1.3.4 紙基傳感器的制作

將whatman1 號定性濾紙裁剪成如圖1 所示形狀，濾紙分成同等大小的3 份并進行折疊（圖2），用3 對圓形超強磁鐵將3 層濾紙吸附住進行部分封閉，將折疊好的濾紙放入加熱融化的石蠟液中，浸沒后立刻取出，待冷卻后將濾紙放入烘箱低溫加熱使石蠟均勻滲透到濾紙間隙中。如圖1 所示，圓形區域未被石蠟浸潤的為親水區，其余已被石蠟浸透的部分為疏水區。將3 mg·mL-1適配體1 功能化的長余輝探針固定在第一層的親水區，4 nmol·L-1適配體2 固定在第二層的親水區，7 nmol·mL-1適配體1 的DNA 互補鏈固定在第三層的親水區，固定結束后將紙基置于37 ℃烘箱內加熱8 h，在最后一層底部粘合吸水墊和底板，最后密封干燥保存。檢測原理如下。當溶液中含有大腸桿菌O157:H7 時，目標致病菌與功能化的長余輝探針結合進入第二層，第二層的適配體2 又與目標致病菌相結合，未結合的長余輝探針則隨著毛細作用進入第三層與適配體1 的DNA 互補鏈相結合，待反應結束后在紫外燈254 nm 下照射激發紙基，則第二層與第三層均有紅色熒光；若溶液中不含目標致病菌，則長余輝探針直接與第三層的適配體1 DNA 互補相結合，紫外燈激發后第二層無熒光現象，第三層有紅色熒光。

圖1 濾紙展開形狀圖

圖2 濾紙折疊方式圖

1.3.5 致病菌檢測

對購買的標準菌株大腸桿菌O157:H7 進行活化，在培養基中37 ℃培養24 h，用接種環取適量細菌于透明玻璃管中，搖勻后與麥氏比濁管進行比對，配制成109CFU·mL-1濃度的菌液，而后將菌液稀釋，搖勻后吸取1 mL 菌液置于培養基中，37 ℃培養24 ～48 h，用平板計數法來確定細菌的濃度。將不同濃度的菌液滴加進第一層親水區，向下滲透一段時間后，用紫外燈照射不同的檢測層以觀察熒光現象確定檢測結果，并將其與無菌水樣品檢測結果進行對照。

2 結果與分析

2.1 材料結構表征

由圖3 可知，將X 射線衍射儀所得材料圖譜與標準圖譜JCPDS：86-0415 對比可知，所有衍射峰均與標準圖譜相符合，這表明所制備的紅色長余輝納米材料具有典型的ZnGa2O4晶相結構。由圖4 可知，納米粒子的平均粒徑為8.6 nm，尺寸差別較小，顆粒呈不規則狀，近圓形，分散性較好。

圖3 ZnGa2O4:Cr3+長余輝材料的XRD 圖譜

圖4 ZnGa2O4:Cr3+在透射電鏡下的形貌特征圖

2.2 光學特性表征

由圖5 可知，合成的紅色長余輝納米材料可在217 ～298 nm 的紫外光條件下激發；由圖6 可知，該材料在發射峰684 nm 處，處于紅色光區域。由圖7 可知，用手提式紫外分析儀在254 nm 條件下照射超聲后的長余輝納米粒子溶液，可見溶液呈現明顯的紅色。

圖5 ZnGa2O4:Cr3+的激發光譜圖

圖6 ZnGa2O4:Cr3+的發射光譜圖

圖7 紅色長余輝材料固體粉末和水溶液在紫外燈激發后的余輝現象圖

2.3 適配體功能化

由圖8 可知，對長余輝材料（PLNPs）、氨基化的長余輝材料（PLNPs-NH2）、與適配體連接的長余輝材料（PLNPs-適配體1）分別進行ζ 電位的測定，氨基功能化后的長余輝材料ζ 電位由+6.29 mV 增加到+10.86 mV，而與適配體連接后的ζ 電位則減少到-12.93 mV，此時納米顆粒帶少量負電荷，證明納米材料適配體功能化成功。

圖8 長余輝材料功能化修飾前后ζ 電位的變化圖

2.4 菌液驗證

將7 種不同濃度的菌液分別滴加到紙基傳感器，15 min 后用紫外燈照射觀察。菌液的濃度依次為7.5×106CFU·mL-1、7.5×105CFU·mL-1、7.5×104CFU·mL-1、7.5×103CFU·mL-1、7.5×102CFU·mL-1、7.5×101CFU·mL-1、0 CFU·mL-1，當菌液濃度大于等于7.5×103CFU·mL-1時，傳感器第二層和第三層均能看到明顯的紅色熒光，當菌液濃度小于7.5×103CFU·mL-1時，傳感器第二層無熒光現象，第三層仍有明顯的紅色熒光。這表明此傳感器最小檢出濃度為7.5×103CFU·mL-1。

用紙基傳感器對濃度為104CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌菌液、7.5×103CFU·mL-1的大腸桿菌O157:H7和104CFU·mL-1的金黃色葡萄球菌的混合液分別進行檢測。由圖9 可知，滴加金黃色葡萄球菌菌液的傳感器只有第三層有紅色熒光，而滴加混合菌液的傳感器第二層和第三層均有紅色熒光，這表明該傳感器可以特異性識別大腸桿菌O157:H7。

圖9 金黃色葡萄球菌菌液和混合菌液檢測結果圖

3 結論

本研究基于適配體功能化的長余輝探針制備了一種能快速檢測大腸桿菌O157:H7 的紙基傳感器，該傳感器可同時測定3 個樣品，特異性高、成本低、操作方便且環境友好，能在15 min 內直觀地讀取檢測結果，對大腸桿菌O157:H7 的最小檢出濃度為7.5×103CFU·mL-1，在應對大批量樣品的現場快速篩查方面有較好的應用前景。