食品微生物檢驗方法的技術(shù)驗證

◎ 劉胤璇，李春江，楊蕊銀，白秀珍

（紅河哈尼族彝族自治州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 蒙自 661199）

方法技術(shù)驗證是實驗室在使用新標準進行檢驗前或在用標準實質(zhì)性變更時，用以證實能夠正確運用這些方法的技術(shù)性驗證過程，是實驗室質(zhì)量管理體系中至關(guān)重要的一環(huán)[1-3]。檢驗檢測機構(gòu)通過方法驗證，可以對方法的適用性進行評價，以確保檢驗數(shù)據(jù)準確可靠。運用不經(jīng)驗證的新方法進行食品檢驗工作，會對結(jié)果造成嚴重影響，輕則發(fā)生數(shù)據(jù)偏差，重則對產(chǎn)品判定結(jié)果造成影響[4]。

目前，仍有很多檢驗檢測機構(gòu)對食品微生物檢驗方法的技術(shù)驗證缺乏認識，引用新標準時，僅通過對標準的培訓、人員能力評價，對照評價設(shè)備、培養(yǎng)基、試劑、環(huán)境等是否符合標準要求來評價該標準的適用性，缺乏技術(shù)性驗證過程[5-6]。本文以《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》（GB 4789.7—2013）方法驗證為例，根據(jù)標準適用范圍及副溶血性弧菌污染海產(chǎn)品的特性，結(jié)合《食品安全國家標準 預包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[7]及《食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[8]要求，選擇水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品兩種基質(zhì)[9-11]作為分析樣本，闡述微生物檢驗方法技術(shù)驗證全過程，從食品微生物檢驗方法驗證技術(shù)參數(shù)、要素的控制，探討微生物檢驗方法驗證工作程序，結(jié)合實例，建立食品微生物檢驗方法技術(shù)驗證基本模式，為食品檢驗檢測機構(gòu)提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品海魚和耗油作為樣品基質(zhì)，樣品稱量后加入副溶血性弧菌（編號ATCC17802，第2 代工作用菌種）菌懸液，按標準要求加入稀釋液，用拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min 制備樣品勻液。

3%氯化鈉堿性蛋白胨水、TCBS 平板、弧菌顯色培養(yǎng)基、3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂、氧化酶試劑、革蘭氏染色劑和干制生化鑒定試劑盒，均由北京陸橋技術(shù)有限責任公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

T500 電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）、PREVI Color Gram 全自動革蘭氏染色儀（法國梅里埃公司）、1 mL/10 mL 移液器（德國普蘭德公司）、BD115 培養(yǎng)箱（德國BINDER 公司）、HBM-400C 樣品均質(zhì)器（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）及數(shù)顯溫濕度計（德國testo 公司）。

1.3 實驗與方法

根據(jù)定性檢驗和定量檢測要求的不同，選擇方法驗證需要控制的驗證要素。定性檢驗，對方法的檢出水平LOD50進行驗證；定量檢測，從估計偏差、精密度、不確定度評定3 方面進行驗證。實驗定性檢驗、定量檢測流程參考《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 副溶血性弧菌檢驗》（GB 4789.7—2013）[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性檢驗

因沒有方法的確認資料，估計LOD50≤3 CFU/測試單元。取副溶血性弧菌標準菌種制備0.5 麥氏濁度菌液，稀釋至10-7，每個稀釋度菌液各取1 mL 至兩個培養(yǎng)皿，加入3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)48 h 后計數(shù)，得到10-6培養(yǎng)皿上菌落數(shù)為19 CFU，按高（10×LOD50）、中（5×LOD50）、低（1×LOD50），3 個接種水平接種量應為30 CFU、15 CFU、3 CFU，制備8 個樣品后，兩個高接種水平樣品中加入1.5 mL 稀釋度10-6菌液，兩個中接種水平樣品中加入0.75 mL 稀釋度10-6菌液，兩個低接種水平樣品中加入0.15 mL 稀釋度10-6菌液，剩余兩個為空白樣品。加入標準菌種后，按GB 4789.7—2013 標準要求進行定性檢驗。參考《微生物檢測方法確認與驗證指南》（RB/T 033—2020）要求，根據(jù)不同污染水平陽性結(jié)果估計LOD50，結(jié)果如表1 所示。

表1 副溶血性弧菌定性檢出水平檢測結(jié)果表

2.2 定量檢測

2.2.1 估計偏差

本次驗證針對水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品兩種基質(zhì)中副溶血性弧菌進行定量檢測。每種基質(zhì)選擇3 個不同生產(chǎn)企業(yè)的不同產(chǎn)品，因所選產(chǎn)品中未檢出目標菌，故進行人工污染。3 個產(chǎn)品稱樣后分別添加10-2、10-3、10-4共3 個稀釋度的菌液0.1 mL，按照GB 4789.7—2013 標準要求進行檢驗。同時，每個稀釋度各取0.1 mL至兩個培養(yǎng)皿，加入3%氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板，36 ℃培養(yǎng)48 h 后計數(shù)，得到10-4培養(yǎng)皿上菌落數(shù)為205 CFU、197 CFU，樣品取樣量為25 g，即加入樣品后樣品中含有副溶血性弧菌量分別為800 CFU·g-1、80 CFU·g-1、8 CFU·g-1。計算檢測結(jié)果與加入量的差值（表2），結(jié)果與對照結(jié)果之差在0.5 lgCFU·g-1以內(nèi)，估計偏差符合要求。

表2 副溶血性弧菌定量檢測估計偏差檢測結(jié)果表

2.2.2 精密度

水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品兩種基質(zhì)各取10 個樣品，稱量后各加入10-3稀釋度的菌液0.1 mL，每個樣品取兩個檢驗單元，分別由檢驗人員A 與B 完成檢驗，定義為檢驗單元A、檢驗單元B。按照GB 4789.7—2013標準要求進行檢驗，檢驗結(jié)果見表3。取對數(shù)結(jié)果求重復性標準偏差，分別為0.113 8%（水產(chǎn)制品A）、0.113 8%（水產(chǎn)制品B）、0.113 8%（水產(chǎn)調(diào)味品A）、0.113 8%（水產(chǎn)調(diào)味品B）。參考《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》（RB/T 151—2016）[13]給出的好氧嗜溫性菌凍蝦的再現(xiàn)性標準偏差為0.18%，此次試驗兩種基質(zhì)所有檢驗單元檢測結(jié)果的重復性標準偏差均小于0.18%，故精密度符合要求。

表3 副溶血性弧菌精密度檢測結(jié)果表 單位：MPN·g-1

2.2.3 不確定度評定

參考李珍等[14]和朱夕濤等[15]的方法，分析副溶血性弧菌定量檢測不確定度分量的來源，見表4。根據(jù)檢驗結(jié)果及不確定度分量來源，計算測量不確定度[15]。檢測結(jié)果對數(shù)值見表5，各不確定度分量結(jié)果見表6。水產(chǎn)制品、水產(chǎn)調(diào)味品中副溶血性弧菌的合成不確定度均為0.110 7，取包含因子k=2，置信概率95%[16]，得到擴展不確定度均為2×0.110 7=0.22 lgMPN·g-1。副溶血性弧菌含量對數(shù)均值均為1.41，則結(jié)果報告為101.41±0.22MPN·g-1。

表4 標準不確定度分量列表

表5 水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品副溶血性弧菌定量檢測對數(shù)結(jié)果表 單位：lgMPN·g-1

表6 副溶血性弧菌定量檢測不確定度評定表

3 結(jié)論

本次方法驗證給出水產(chǎn)制品和水產(chǎn)調(diào)味品定性檢驗檢出水平分別為2 CFU/測試單位、3 CFU/測試單位，不高于預估檢出水平，滿足要求。水產(chǎn)制品3 種污染水平定量檢測副溶血性弧菌的估計偏差分別為0.35 lgCFU·g-1、0.27 lgCFU·g-1、0.24 lgCFU·g-1，水產(chǎn)調(diào)味品的估計偏差為0.35 lgCFU·g-1、0.27 lgCFU·g-1、0.24 lgCFU·g-1，均小于0.5 lgCFU·g-1，符合要求；重復性標準偏差均為0.113 8%，小于《食品微生物定量檢測的測量不確定度評估指南》（RB/T 151—2016）給出的再現(xiàn)性標準偏差0.18%，符合要求；方法的擴展不確定度為0.22 lgMPN·g-1（k=2，置信概率95%）。實驗從檢出水平、估計偏差、精密度、不確定度評定等方面構(gòu)建了副溶血性弧菌檢測方法驗證的基本模式，驗證結(jié)果滿意，同時給出了不確定度評定方案，為實驗室制定判定規(guī)則提供了參考。

食品微生物檢驗實驗室正確地實施方法驗證，可以有效控制方法使用過程中的風險[5]。根據(jù)本研究中實例分析，建立微生物方法技術(shù)驗證的基本模式，首先根據(jù)方法范圍和實驗室申請擴項范圍，選定合適的基質(zhì)，針對不同基質(zhì)進行技術(shù)驗證，做到基質(zhì)全覆蓋；定性檢驗時對檢出水平進行驗證；定量檢測時從估計偏差、精密度、不確定度評定3 方面進行驗證。除此之外，還可根據(jù)實驗室需要，增加能力驗證[17]、實驗室間比對等方式，輔助完成方法驗證，從而提升實驗室檢測能力，確保出具的數(shù)據(jù)準確可靠。