蘇黃止咳膠囊對豚鼠咳嗽高敏模型的抗炎止咳作用研究

李錦帥,楊子嫻,王 韜,賈 丹,王亞瓊,熊 廣,謝 緯,陳 生,李敏芳,4

(1.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院,廣東 深圳 518033;2.深圳市中醫院,廣東 深圳 518033;3.暨南大學中醫學院,廣東 廣州 510632;4.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院,廣東 廣州 510006)

咳嗽高敏綜合征病因尚不明確,主要特征為對各種刺激性物質或條件產生異常敏感的咳嗽反應,臨床中以慢性刺激性干咳為主要表現,目前其發病機制存在爭議[1-2]。相關研究表示,慢性咳嗽患者普遍存在氣道管壁增厚、支氣管上皮受損伴杯狀細胞增生、基底膜增厚和肥大細胞慢性炎癥浸潤[3-4]。大量慢性咳嗽患者存在肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、神經肽P物質(Substance P,SP)、降鈣素基因相關肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)高水平[5-8]。目前咳嗽高敏綜合征臨床治療效果不理想,且存在較多不良反應,給患者的社交、心理等方面帶來了極大的負擔[9-10]。國醫大師晁恩祥認為咳嗽敏感性增高的特點與風邪致病特點之“風善行數變”“風性攣急”“無風不作癢”等相契合,故將其歸屬于“風咳”范疇,并提出治療時應從“風”論治,以疏風宣肺、緩急止咳為法[11]。國醫大師晁恩祥結合多年臨床經驗研制出蘇黃止咳膠囊[12]。多項研究表明蘇黃止咳膠囊治療感染后咳嗽、咳嗽變異性哮喘等呼吸系統疾病安全有效[13-16]。現代藥理學證實蘇黃止咳膠囊組成中9種中草藥具有75種活性成分[17]。其中五味子的活性物質總木脂素具有治療慢性咳嗽的潛力[18]。基于蘇黃止咳膠囊良好的抗炎止咳效果,本研究旨在對蘇黃止咳膠囊改善咳嗽高敏模型的抗炎止咳作用進行探究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:普通級別雄性白化豚鼠36只,體重為300～350 g,皆購自珠海百試通生物科技公司,生產許可證號:SCXK(粵)2020-0051。以上豚鼠在廣州中醫藥大學實驗動物中心飼養,許可證號:SYXK(粵)2018-0085。

1.1.2 實驗藥物與試劑:蘇黃止咳膠囊(國藥準字23060991);磷酸可待因片(批號20190601,國藥集團);苯酚、濃硫酸、乙醇、水合檸檬酸(批號90-72-2、64-17-5、7664-93-9、5949-29-1,西隴科學);磷酸鹽緩沖液(批號MA0015,Meilunbio公司);紅細胞裂解液(批號HRA2081,荷瑞生物);4%多聚甲醛(批號HM0123,廣州浩瑪);蘇木素、伊紅染液(批號 G1004、G1005,西隴科學);IL-1β、TNF-α試劑盒(批號 JER-01、JER-06,安徽巧伊);SP試劑盒(批號D751030,上海生工);CGRP試劑盒(批號 CSB-E08211r,華美生物)。

1.1.3 實驗儀器:大動物用全身體積描記系統(WBP型,上海塔望智能科技);低溫離心機(5430R型,美國Thermo Scientific公司);多功能血細胞分類儀(BM2型,東吳醫用電子儀器廠);多功能酶標儀(Multiskan GO型,美國Thermo Scientific公司);實驗室用制冰機(MR46AS+NB393型,上海冠森生物);混合研磨器(LUKYM-1型,廣州華創);超聲波霧化器(WH-2000型,廣東粵華)。

1.2 實驗方法

1.2.1 豚鼠分組、造模及給藥:36只豚鼠按照隨機分組原則分為空白對照組、模型組、可待因組以及蘇黃止咳膠囊低、中、高劑量組,每組6只。首先適應性喂養1周,隨后,除空白對照組外,其他組參照參考文獻[19]建立煙草煙霧誘導的咳嗽高敏豚鼠模型。具體操作為將豚鼠置于煙霧染毒箱,煙熏14 d,2次/d,每次20 min,并確保兩次煙熏的時間間隔大于6 h。第15天對豚鼠進行灌胃給藥。蘇黃止咳膠囊低、中、高劑量組分別予0.18、0.36、1.8 g/(kg·d)蘇黃止咳膠囊溶液灌胃。可待因組接受磷酸可待因混懸液30 mg/kg灌胃。空白對照組和模型組豚鼠則灌胃等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 豚鼠咳嗽敏感性檢測:末次給藥1 h后,將豚鼠單獨置于密封的透明暴露箱(25 cm×12 cm×12 cm)中,暴露箱兩側均有換氣口,開始進行暴露。使用超聲霧化器霧化引咳劑,可使其在空氣中的顆粒直徑保持在1～5 μm,每分鐘霧化0.5 mol/L的含水檸檬酸0.5 ml,霧化5 min,觀察10 min。由經過訓練的2名觀測者連續監測豚鼠的咳嗽次數及聲音。同時使用大動物用全身體積描記系統記錄豚鼠的咳嗽次數以及咳嗽潛伏期。

1.2.3 豚鼠肺泡灌洗液取材及處理:固定豚鼠,腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉,隨后進行氣管切開和插管,并同時結扎右肺,以6 ml預冷的0.9%氯化鈉溶液分3次緩慢注入左肺進行灌洗。將得到的BALF置于10 ml的離心管中,以1500 r/min的速度在4 ℃條件下離心5 min。離心后,輕輕吸取離心管上清液,然后將其分裝至潔凈的離心管中,并保存至-80 ℃冰箱備用,ELISA法檢測相關細胞因子水平。

1.2.4 炎癥細胞計數與分類:將離心后的BALF細胞沉淀加入500 μl的PBS溶液,然后懸浮細胞,取10 μl的懸浮液加入血細胞計數板,借助光學顯微鏡對各類炎癥細胞進行計數。取100 μl細胞懸液制備細胞涂片,自然風干后置于10%中性福爾馬林中進行細胞形態的固定,固定時間大于24 h。HE染色、干燥后,對炎癥細胞進行分類計數。

1.2.5 BALF中炎癥因子檢測:遵循試劑盒的詳細操作說明,采用ELISA法測定BALF中的炎癥因子IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平。

1.2.6 氣道組織及肺組織病理觀察:取得主支氣管及右下肺組織后,置于10%福爾馬林溶液中浸泡固定,然后進行石蠟包埋,制備切片厚度為4 μm。經過HE染色,最后在光學顯微鏡下觀察肺組織的病理改變。

2 結 果

2.1 蘇黃止咳膠囊對咳嗽高敏豚鼠咳嗽次數及咳嗽潛伏期的影響 見表1。與空白對照組比較,模型組豚鼠的咳嗽次數增加,咳嗽潛伏期縮短(均P<0.01);蘇黃止咳膠囊各劑量組及可待因組相對于模型組,咳嗽次數顯著減少(P<0.01),咳嗽潛伏期延長(P<0.05,P<0.01)。

表1 各組豚鼠咳嗽次數及咳嗽潛伏期比較

2.2 蘇黃止咳膠囊對咳嗽高敏豚鼠BALF中炎癥細胞的影響 見表2。模型組BALF中白細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞淋巴細胞計數均顯著高于正常對照組(P<0.05,P<0.01);蘇黃止咳膠囊各劑量組BALF中白細胞、中性粒細胞均顯著低于模型組(P<0.01);蘇黃止咳膠囊高劑量組BALF中的嗜酸性粒細胞計數顯著低于模型組(P<0.05);蘇黃止咳膠囊低劑量組BALF中淋巴細胞計數低于模型組(P<0.05)。

表2 各組豚鼠BALF中炎性細胞計數比較(×109/L)

2.3 蘇黃止咳膠囊對咳嗽高敏豚鼠BALF中IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平的影響 見表3。模型組BALF中的IL-1β、TNF-α、SP、CGR水平均顯著高于空白對照組(P<0.01)。蘇黃止咳膠囊中、高劑量組BALF中的IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平均顯著低于模型組(P<0.01)。

表3 各組豚鼠BALF中IL-1β、TNF-α、SP、CGRP水平比較(pg/ml)

2.4 蘇黃止咳膠囊對咳嗽高敏豚鼠肺組織病理學的影響 見圖1。空白對照組豚鼠的肺組織鏡下顯示氣道上皮細胞整齊排列,無充血和水腫,肺泡結構完整,炎癥浸潤較少,氣管腔內也未見明顯炎性浸潤。模型組和可待因組豚鼠的肺組織鏡下顯示氣道上皮細胞排列紊亂,氣管和細支氣管黏膜炎性水腫,炎癥細胞浸潤顯著,管腔中存在大量滲出物,肺泡間隔增寬,部分肺泡出現塌陷。與模型組相比,蘇黃止咳膠囊各劑量組豚鼠肺組織中炎癥浸潤減輕,管腔滲出物也顯著減少。

A:空白對照組;B:模型組;C:可待因組;D:蘇黃止咳膠囊低劑量組;E:蘇黃止咳膠囊中劑量組;F:蘇黃止咳膠囊高劑量組圖1 各組豚鼠肺組織病理學改變(HE染色,×200)

3 討 論

咳嗽高敏綜合征的發生受多種因素影響,比如氣道炎癥、咳嗽中樞敏化和神經源性炎癥等[20]。氣道炎癥在咳嗽高敏綜合征中占重要作用,當呼吸道黏膜受到外界刺激時,會激活氣道炎癥反應,導致中性粒細胞計數增加,本研究中蘇黃止咳膠囊各劑量組顯著低于模型組豚鼠BALF中白細胞計數及中性粒細胞計數水平,表明蘇黃止咳膠囊有助于抑制氣道炎癥細胞的釋放。氣道炎癥反應發生的同時伴隨IL-1β、TNF-α等炎癥介質水平的升高[21],這些炎癥介質的刺激可激活咳嗽感受器,進而提高咳嗽纖維傳入神經末梢C纖維的敏感性,從而導致咳嗽閾值下調。本研究中低、中、高劑量蘇黃止咳膠囊可顯著下調BALF中IL-1β、TNF-α水平,氣道炎癥介質的釋放減少可進一步減少對咳嗽感受器的刺激且能降低咳嗽纖維傳入神經的敏感性;當咳嗽中樞被激活時,SP物質的釋放增加會導致傳入信號的放大和咳嗽反應的加強。研究表明,使用SP拮抗劑治療后,豚鼠的咳嗽敏感性明顯減弱[22]。目前認為C纖維被激活后神經遞質釋放增多可能在慢性咳嗽中扮演重要角色,C纖維中釋放的神經遞質主要包括SP、CGRP等,在吸入刺激性物質后可誘導SP釋放增多并引起咳嗽,且慢性咳嗽患者咳嗽敏感性與其BALF中CGRP水平呈正相關[23]。本研究中,中、高劑量蘇黃止咳膠囊可顯著下調BALF中SP、CGRP水平,SP物質的減少可以減弱咳嗽傳入信號且使氣道對刺激的敏感性降低,CGRP水平的下降可以減輕咳嗽反應且進一步降低咳嗽敏感性。

晁恩祥教授對咳嗽、肺痿等疾病有較深的見解,蘇黃止咳膠囊由國醫大師晁恩祥研發[24]。臨床中部分患者咳嗽癥狀遷延難愈且突發突止,運用常規散寒、清熱等方法不能奏效。國醫大師晁恩祥結合多年臨床經驗,認為咳嗽遇刺激性而發、突發突止、咽癢等特點與風邪致病特點相契合,由此創立“風咳”理論,將其病因病機歸納為風邪犯肺,肺失宣肅,并強調治療時應從風論治。蘇黃止咳膠囊諸藥并用,共奏疏風宣肺、止咳利咽之功,可以有效緩解咳嗽癥狀并改善肺功能[25-26],且現代藥理學證明蘇黃止咳膠囊具有抗組胺、降低炎癥因子水平等作用[27]。

綜上所述,蘇黃止咳膠囊可能通過抑制氣道炎癥的發生和炎癥介質的釋放,減少刺激咳嗽感受器,并且還可能通過下調SP、CGRP的水平,縮小咳嗽傳入信號并且減輕咳嗽反應,最終降低豚鼠模型的咳嗽敏感性,然而具體的通路仍需進一步研究。本研究為治療咳嗽高敏綜合征提供了新的思路,但本研究為動物研究,選用的豚鼠均為雄性,可能會對研究結果造成偏倚,未來還需要在真實世界中進行人類大樣本的隨機對照試驗來驗證其具體作用。