祛風止痙膠囊對支氣管哮喘大鼠氣道炎癥及TRPV1通路的影響

武玉剛,朱玉龍,馬紅霞

(新疆醫科大學附屬中醫醫院,新疆 烏魯木齊 830000)

哮喘是呼吸系統疾病中常見的慢性氣道炎癥性疾病之一,近年來哮喘的發病率逐年增長[1]。支氣管哮喘最主要的臨床表現是氣道高反應,目前對于哮喘的治療分為急性發作期與緩解期,急性發作期以糖皮質激素及短效β2受體激動劑為主,雖然癥狀改善明顯,但伴隨而來的真菌感染及代謝紊亂等不良反應不容忽視。支氣管哮喘在中醫稱為“哮病”。哮病的基本病機為“伏痰”,外邪侵襲是其主要病因,外邪犯肺而致痰隨氣升,氣因痰阻,相互搏結,壅塞氣道,從而痰鳴如吼,氣息喘促,“風邪”是其主要誘發因素[2]。因此,在哮病的治療上,朱丹溪等古代醫家也早已提出了祛風止痙法。祛風止痙方是李風森教授基于多年治療哮喘的臨床經驗總結而成。本研究通過觀察支氣管哮喘大鼠予祛風止痙膠囊灌胃后瞬時受體電位香草酸亞型1(TRPV1)蛋白分子表達變化以及外周血白介素(IL)-4、IL-13、IL-5、IL-17水平的變化,進一步揭示祛風止痙膠囊對哮喘大鼠TRPV1蛋白分子表達的影響,研究支氣管哮喘炎癥因子與TRPV1蛋白的相互關系,為進一步研究祛風止痙膠囊治療哮喘的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:健康雄性Wister大鼠60只,體重180～220 g,8～10周齡,均由浙江維通利華實驗技術有限公司提供。適應性飼養1周后,建造大鼠哮喘模型,將50只哮喘大鼠按照隨機數字表法分為模型組、陽性對照組和祛風止痙膠囊低劑量組、中劑量組、高劑量組。

1.1.2 實驗藥物與試劑:祛風止痙膠囊(白僵蠶、蟬衣、地龍)由新疆維吾爾自治區中醫院藥研室提供,將藥物加蒸餾水混合均勻并配制成所需濃度,呈混懸液狀備用。卵蛋白(批號20180709,美國sigma公司);TRPV1抗體試劑盒(批號04913850001,Affinity公司);IL-17A ELISA試劑盒(批號15596-026,NeoBioscience公司);IL-5 ELISA試劑盒(批號AB5370,Abcam公司);IL-4 ELISA試劑盒(批號CK-E20011M,Raybiotech公司);HRP結合二抗(批號D60029,中杉金橋公司);瓊脂糖(批號A610013-0250,上海生工)。

1.1.3 實驗儀器:冷凍離心機(型號Heraeus Multifuge X1R,賽默飛世爾科技公司);漩渦混合器(型號GL-88B,海門市其林貝爾儀器制造有限公司);超微量分光光度儀(型號Tnano701,上海凈信);電泳儀電源(型號BG-Power600,濟南歐萊寶生物技術有限公司);垂直電泳槽(PROTEAN Tetra,濟南歐萊博科學儀器有限公司);凝膠成像儀(HD-HN1100,山東環美分析儀器有限公司);PCR儀(型號MyCycler Thermal Cycler,美國Bio-Rad);Real Time instrument(型號ABI 7500Fast);電熱恒溫培養箱(型號KD-8D,上海精宏)。

1.2 實驗方法

1.2.1 哮喘模型的建立:采用腹腔注射OVA致敏、連續6次呼吸道霧化吸入OVA誘導氣道變應性炎癥[3]。實驗第1天,臨時配制10%OVA溶液,大鼠腹腔注射1 ml以致敏,第15天將致敏的大鼠于透明玻璃罩內,給予1%OVA溶液進行超聲霧化(霧化量由小到大)15 s,然后自然吸入15 s,出現呼吸頻率加快、點頭呼吸、咳嗽、抽搐等癥狀時為引喘成功。此后,每隔1 d以1%OVA溶液誘導,按最大霧量,自然吸入15～30 s,使哮喘反復發作,連續8 d(共4次)。

1.2.2 給藥:高劑量組(1.6 g/ml)、中劑量組(0.5 g/ml)、低劑量組(0.2 g/ml)分別給予中藥混懸液4 ml/次,連續灌藥10 d,每日1次[4]。正常組不給予任何藥物干預,正常飼養。陽性對照組予布地奈德混懸液1 mg/kg,連續霧化10 d,每日1次。模型組:給予0.9%氯化鈉溶液10 ml超聲霧化,連續霧化10 d,每日1次。干預第10天,各組大鼠處死取材。

1.2.3 標本采集:①大鼠處死并取腹主動脈血,將血置于EDTA抗凝管中,其中取2 ml無抗凝血置于4 ℃低溫水平離心機中,離心后取上清液并置于-80 ℃冰箱中保存備用。②將取完血的大鼠夾閉右肺,經氣管插管給予10 ml的0.9%氯化鈉溶液行左肺肺泡灌洗,0.9%氯化鈉溶液經氣道緩慢注入左肺直至肺慢慢變至蒼白、膨脹,出現阻力后慢慢回收液體,反復3次后將回收的肺泡灌洗液離心并取上清液標記分裝于-80 ℃冰箱中保存備用。③取右肺中葉肺組織置于10%福爾馬林中固定72 h,脫水,石蠟包埋,切片,乙醇梯度洗脫,蘇木素染色10 min,伊紅染色液染色30 s,梯度酒精脫水,光學顯微鏡下觀察肺組織黏膜病理學改變。

1.2.4 ELISA檢測大鼠外周血中炎癥因子水平:取大鼠外周血,離心后分離血清,ELISA法檢測各組大鼠血清中IL-5、IL-4、IL-13及IL-17的含量。按試劑盒說明書進行操作。

1.2.5 Western blot檢測肺組織TRPV1蛋白:將肺組織研碎后加入蛋白裂解液(IP/RIPA),離心取上清,BCA法蛋白定量計算各蛋白濃度,加入4×蛋白上樣緩沖液100 ℃使蛋白變性。根據蛋白分子量配制10%分離膠5 ml、5%濃縮膠3 ml,配制電泳液,將蛋白轉印至PVDF膜上,將PVDF膜依次放置在保鮮膜上鋪展開,將配制好的發光劑快速均勻的加在4 ℃恒流轉膜2 h,配制5%脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗TRPV1(1∶500)與GAPDH(1∶500),置于旋轉搖床上4 ℃過夜。TBST漂洗4次,室溫二抗孵育2 h后,TBST漂洗4次,目的條帶加入ECL化學顯影液,在化學發光凝膠成像儀檢測蛋白的表達。將獲得的圖像在Image J分析軟件計算灰度值。

1.2.6 Real-time PCR檢測各組肺組織TRPV1 mRNA:從樣本中提取總RNA,電泳檢測其完整性。使用逆轉錄酶和隨機引物反向合成cDNA。TRPV1 mRNA轉錄水平采用實時熒光定量PCR檢測。PCR反應:變性95 ℃ 40 s,退火54 ℃ 42 s,延伸68 ℃ 50 s,26個循環反應結束后分析樣品信號熒光強度測定的數據,以2-ΔΔCt法計算TRPV1 mRNA表達水平。使用GAPDH作為內參,TRPV1-F:5’-AGATCACCAACAGGAAGGGG-3’,TRPV1-R:5’-TAAAGGGAGGAGTGCACTGG-3’,產物大小為125 bp。

1.2.7 觀察大鼠肺組織HE染色病理變化:取材后,標本在預冷的PBS中沖洗干凈,由4%多聚甲醛固定24 h以上,梯度酒精脫水,對組織行石蠟包埋、切片厚5 μm,常規脫蠟入水并修復,滴加TRPV1一抗(1∶200),4 ℃冰箱過夜,PBS溶液清洗3次,每次5 min,在組織切片上滴加適量的生物素標記山羊抗鼠/兔IgG,37 ℃孵育20 min,PBS溶液清洗3次,每次5 min,在組織切片上滴加適量的辣根酶標記鏈酶卵白素工作液,37 ℃孵育20 min,PBS溶液清洗3 次,每次5 min,在組織切片上加入適量新鮮配制的DAB顯色,觀察到棕色結果停止顯色,脫水、透明、封片,顯微鏡下觀察并計數陽性細胞及強度。

1.3 統計學方法 使用SPSS 27.0統計學軟件進行數據分析。驗證各組測量資料是否滿足正常分布和分散,并使用單因子分散分析比較各組測量資料;P<0.05為差異有統計學意義。滿足正態分布的雙變資料相關性分析采用Pearson相關分析法。各組大鼠IL-4、IL-13、IL-5、IL-17、TRPV1蛋白及mRNA表達的實驗數據使用單因素方差進行分析;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平比較 見表1。模型組IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平高于正常組,差異有統計學意義(均P<0.05);低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組的各指標水平低于模型組,差異有統計學意義(均P<0.05);高劑量組的各項指標水平低于陽性對照組,差異有統計學意義(均P<0.05)。

表1 各組大鼠血清IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平比較

2.2 各組大鼠肺組織TRPV1蛋白表達比較 見表2(圖1)。陽性對照組TRPV1蛋白表達高于正常組(P<0.05);模型組TRPV1蛋白表達高于中劑量組、低劑量組、陽性對照組、高劑量組(均P<0.05);高劑量組TRPV1蛋白表達低于陽性對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。

A:正常組;B:模型組;C:陽性對照組;D:低劑量組;E:中劑量組;F:高劑量組圖1 各組大鼠肺組織TRPV1蛋白表達電泳圖

表2 各組大鼠肺組織TRPV1蛋白表達比較

2.3 各組大鼠肺組織TRPV1 mRNA表達比較 見表3。正常組肺組織TRPV1 mRNA表達低于模型組(P<0.05),陽性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的TRPV1 mRNA表達低于模型組,差異有統計意義(均P<0.05)。

表3 各組大鼠肺組織TRPV1 mRNA表達比較

2.4 各組大鼠肺組織病理學改變 見圖2。與正常組比較,模型組大鼠氣道和肺組織中有大量炎癥細胞浸潤,氣管黏膜充血水腫,杯狀細胞增殖,支氣管分泌物增多;與模型組比較,各給藥組大鼠組織炎癥細胞浸潤程度減輕,其中高劑量組減輕最為明顯。20倍光鏡下觀察免疫組化結果,通過棕色深淺將染色強度分為0～3級,通過陽性細胞與細胞核的比值估算陽性率(0～100),最終結果為染色強度×陽性率,數值范圍是0～300。

A:正常組;B:模型組;C:陽性對照組;D:低劑量組;E:中劑量組;F:高劑量組圖2 各組大鼠肺組織病理學改變(HE染色,×200)

3 討 論

支氣管中的嗜酸性粒細胞、非對稱細胞及T淋巴細胞等多種炎癥細胞共同組成的呼吸道慢性炎癥為支氣管哮喘,其以反復發作的喘息、呼吸急促、胸悶或咳嗽為主要臨床癥狀[5]。支氣管哮喘的發病機制目前仍未能明確,與免疫、遺傳、神經受體明顯相關[6]。哮喘是因機體Th1/Th2失衡引起的,病理特征主要包括氣道炎癥等,其中慢性呼吸道炎癥是哮喘形成的核心因素,也是呼吸道高反應性的重要原因[7]。目前哮喘藥物治療的主要手段是抑制呼吸道慢性炎癥因子的釋放。炎癥因子如IL-4、IL-13、IL-5,可在Th2細胞受到外部刺激時釋放出來,其中IL-5是調節嗜酸性粒細胞增殖、分化、積聚的關鍵性因子。哮喘患者中IL-5在肺組織大量釋放,誘導嗜酸性粒細胞浸潤或集中于肺組織,從而引起呼吸道炎癥和肺組織病理變化[8]。IL-4可促進Th2分化,活化B細胞,生成免疫球蛋白E(IgE),肥大細胞脫顆粒,釋放組胺、肝素、白三烯等多種炎癥因子,使得支氣管收縮[9]。IL-4的大量分泌還可抑制Th1細胞分泌IFN-γ,IFN-γ可以抑制IgE合成,并且調節免疫反應[10]。IL-4在誘導漿細胞產生IgE以及上調肥大細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞和B細胞中FcRⅠ和MHc Ⅱ類分子的表達方面發揮關鍵作用。IL-4被認為是Th2主開關,可在敏性疾病中驅動Th2細胞產生其他促過敏細胞因子,如IL-5和IL-13。IL-4促進髓系樹突狀細胞的發育,并參與Th2細胞和嗜酸性粒細胞向炎癥部位的遷移,IL-4和IL-13均激活B細胞合成IgE,誘導杯狀細胞增生,觸發氣道高反應性和黏液高分泌。哮喘的發生發展除了Th2細胞及其細胞因子起主要作用外,Th17細胞及其細胞因子包括IL-17也發揮關鍵作用[11]。Treg/Th17的免疫失衡也是哮喘發病的重要機制之一。IL-17不僅能募集中性粒細胞,還作用于嗜酸性粒細胞增強氣道炎性反應[12]。對于激素抵抗哮喘的中性粒細胞氣道炎癥,來源于Th17細胞的IL-17和來源于巨噬細胞的IL-18和腫瘤壞死因子-α參與了哮喘的發病[13]。與健康對照組相比,在哮喘患者的痰液、鼻腔和支氣管活檢以及血清中觀察到IL-17水平升高,IL-17水平較高的患者有更嚴重的哮喘表型。研究表明,靶向IL-17通路可能對哮喘有益,由于Th17/IL-17軸的激活增加與吸入糖皮質激素敏感性降低相關,靶向IL-17途徑可能逆轉吸入性糖皮質激素的無反應性[14]。

TRPV1是一種非選擇性的陽離子通道,對鈣離子有高滲透性,并為鈣離子從細胞器中釋放出來提供通道,從而改變細胞內鈣離子的濃度,調節機體的重要生理過程。TRPV1通道由熱、疼痛、辣椒素等外部刺激物質激活,可誘發鈣類及螺旋體縮氨酸、鈣素基因相關縮氨酸的釋放,感覺神經縮氨酸作用于呼吸道的部分效應細胞(如平滑肌、膽堿神經節、黏液腺等),誘發細胞周圍軸突反射、支氣管收縮、蛋白質滲出、炎癥細胞取向等[15-16]。在OVA誘導的哮喘小鼠模型中,TRPV1在肺組織中的表達顯著升高,其肺泡灌洗液中Th2細胞相關細胞因子IL-3、IL-5和IL-13顯著升高,而使用TRPV1抑制劑治療的哮喘小鼠IL-3、IL-5和IL-13顯著降低[17-18]。研究發現,氣道的抗炎作用可能與TRPV1對氣道上皮細胞因子和Th2相關細胞因子的下調有關[19]。

支氣管炎哮喘常在清晨或夜間急性發作,隨著病程的延長,可能發生呼吸道變窄[20]。常規西藥治療雖然能緩解急性發作癥狀,但隨著病程延長可產生耐藥性,病情反復,中醫治療標本兼顧,辨證論治,可增強患者的免疫力,減輕急性發作時的癥狀,并可減少急性發作次數。中醫治療哮喘遵“急則治其標”“緩則治其本”的原則,前中期以強腎益肺、平喘止咳為主[21]。“祛風止痙”是歷代醫家治療哮喘的重要方法,從“風”論治,以“疏風宣肺、解痙平喘”治療風痰哮癥,療效顯著。祛風止痙膠囊中蟬蛻、僵蠶、地龍共用可祛風止痙,恢復肺的宣發肅降功能,從而改善哮喘的臨床癥狀及預后[22]。中藥蟬蛻性寒涼,《中華臨床中藥學》中稱其可以“止咳降氣,主治咳嗽氣喘”[23];白僵蠶可息風止痙,散結消痰,醫風邪入體等癥[24];地龍水煎液可抑制呼吸道過敏,抗組胺,改善哮喘患者呼吸道重構現象[25]。

在本次實驗中,模型組哮喘大鼠的血清IL-4、IL-13、IL-5、IL-17均高于正常組,陽性對照組及低、中、高劑量組血清IL-4、IL-13、IL-5、IL-17均低于模型組,進一步驗證了祛風止痙膠囊可降低哮喘大鼠血清細胞因子IL-4、IL-13、IL-5、IL-17的分泌水平。實驗發現模型組哮喘大鼠TRPV1蛋白及mRNA表達高于正常組;陽性對照組及低、中、高劑量組TRPV1蛋白及mRNA表達低于模型組,高劑量組的IL-4、IL-13、IL-5、IL-17水平及TRPV1蛋白表達低于陽性對照組,進一步證明了祛風止痙膠囊可降低哮喘大鼠的TRPV1表達。

綜上所述,祛風止痙膠囊可能通過對哮喘患者Th2炎癥因子的下調,下調IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平,降低TRPV1表達,從而減輕哮喘的氣道高反應性。