色譜結合光譜技術建立棗仁寧神膠囊質量控制方法※

郭丁妮，席嘯虎

（山西省中醫藥研究院，山西太原 030012）

棗仁寧神膠囊由炒酸棗仁、珍珠母、百合、郁金、茯苓、首烏藤、太子參、苦參、丹參、烏梅、合歡皮、全蝎、甘草等組成，具有養心安神、健脾養血的功效，可用于治療心煩、心悸、失眠多夢、健忘、焦慮等癥。棗仁寧神膠囊為本院院內制劑，目前醫院制劑質量控制手段主要為處方中1／3以上藥味完成薄層色譜法（TLC）定性檢測及1味以上關鍵藥味指標成分完成含量測定［1］。文獻報道，可采用TLC進行中藥制劑定性檢測和高效液相色譜（HPLC）進行定量檢測［2-4］。在實際操作過程中，此標準還有一些待改進之處：醫院制劑基本為水提，大多藥材水提后指標成分轉移率較低，檢測效果不佳；TLC及HPLC不能有效驗證動物類藥材，同時不能對制劑的綜合成分進行分析；TLC和HPLC技術需要的人力、財力和時間較多。醫院制劑質量控制需對制劑中不同功效藥材的綜合成分進行綜合把控，對主要藥材及其主要成分進行重點把控，并合理、有效、及時地反饋質量信息［5］。近紅外光譜技術（NIRS）是一種間接分析技術，具有分析速度快、多成分分析、分析成本低等優點，可用于中藥定性鑒別、有效成分定量分析等方面的研究［6-8］。本研究采用色譜結合NIRS，通過建立指紋圖譜和近紅外快速檢測模型，對棗仁寧神膠囊的綜合成分和主要藥材進行質量控制分析，以探索適合醫院制劑質量控制的評價體系。

1 儀器與藥材

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀（Agilent公司）；Alltech 3300蒸發光散射檢測器（Grace公司）；C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）（Agilent公司）；AntarisⅡ傅立葉近紅外光譜儀（美國Thermo Fisher公司）；BP211D、BP310P電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥 棗仁寧神膠囊為山西省中醫藥研究院院內制劑，收集2019年3月至2021年8月共18個批次用于本研究。棗仁寧神膠囊的組成藥物炒酸棗仁、珍珠母、百合、郁金、茯苓、首烏藤、太子參、苦參、丹參、烏梅、合歡皮、全蝎、甘草經山西省中醫藥研究院藥劑科主任藥師鑒定，符合《中華人民共和國藥典》標準。

1.3 試劑 對照品丹參素鈉（批號：110855-201915，質量分數純度＞98%）、甘草苷（批號：111610-202209，純度質量分數＞98%）、大黃素（批號：110756-201913，純度質量分數＞98%）購自中國藥品生物制品檢定所。芹糖甘草苷（批號：190907，質量分數純度＞98%）、甘草素（批號：191018，純度質量分數＞98%）購自上海融禾醫藥科技發展有限公司。其余試劑為分析純或色譜純。

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜及指標成分含量測定

（1）色譜條件 色譜柱為C18（250 mm×4.6 mm，5μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～10 min，5%A；10～60 min，5%～40%A；60～70 min，40%～5%A），流速為1 m L·min－1；柱溫為30℃，波長為230 nm，進樣量為10μL。

（2）溶液的制備及色譜圖 ①對照品溶液的制備：精密稱定丹參素鈉、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、大黃素等對照品適量，加甲醇配制成一定質量濃度的對照品溶液，濃度依次為：200.2、66.2、54.6、61.2、109.8μg／m L。②供試品溶液的制備：稱取棗仁寧神膠囊粉末2.5 g，精密稱定，置100 m L具塞錐形瓶中，加85%甲醇100 m L，稱定重量，80℃水浴中加熱回流30 min，超聲處理20 min，冷卻，補足重量，取續濾液，即得。棗仁寧神膠囊對照品及供試品色譜圖見圖1、圖2。

圖1 棗仁寧神膠囊對照品色譜圖

圖2 棗仁寧神膠囊供試品色譜圖

（3）方法學考察 取20210614批次棗仁寧神膠囊若干份，每份約2.5 g，精密稱定，運用HPLC同時檢測棗仁寧神膠囊中5種化學成分的含量，進行系統的方法學考察。結果顯示，丹參素鈉、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、大黃素精密度相對標準偏差（RSD）依次為1.77%、1.97%、2.01%、1.12%、1.25%（連續進樣5次），重復性RSD 依次為2.85%、2.36%、2.66%、1.54%、2.38%（連續進樣5次），穩定性（樣品溶液制備后1、2、4、6、12 h）RSD 依次為1.02%、1.14%、1.33%、1.85%、0.95%（連續進樣5次），說明該方法具有較高的準確性。加樣回收率結果見表1。

表1 棗仁寧神膠囊加樣回收率結果

（4）特征圖譜的建立及5種成分含量下限確定選擇2019年3月至2021年8月本院生產棗仁寧神膠囊的13個批次，按照2.1項下“色譜條件”構建特征圖譜，結果見圖3。通過對指紋圖譜進行分析，發現13個共有峰，其中可指認色譜峰5個，依次為丹參素鈉（3號峰）、芹糖甘草苷（6號峰）、甘草苷（8號峰）、甘草素（10號峰）、大黃素（12號峰），平均含量依次為0.181 8%、0.030 6%、0.022 7%、0.053 4%、0.002 6%，含量下限按平均值下浮20%，依次確定為0.145 5%、0.024 5%、0.018 1%、0.042 8%、0.002 1%，具體見表2。

表2 棗仁寧神膠囊5種指標成分含量下限確定

圖3 棗仁寧神膠囊特征圖譜

2.2 NIRS光譜分析

（1）圖譜的采集 醫院制劑室實際生產工藝優化后做實驗室研究，全蝎、太子參、百合直接粉碎，其余加水浸泡2 h，提取2次，每次2 h，過濾，取濾液，濃縮至一定濃度，加全蝎、太子參、百合粉末，混勻，干燥，粉碎，過篩。根據上述實驗設計，分別制備包含酸棗仁、珍珠母的全處方原方劑量提取物及依次缺失上述單味藥的對照提取物，按制劑制備工藝制成粗粉，備用。共制備棗仁寧神方全方提取物粗粉20批次，缺棗仁方提取物粗粉15批次，缺珍珠母方提取物粗粉15批次。各樣品置于樣品杯中，等量裝樣，約5 g，有效覆蓋樣品杯底面。采集條件：分辨率8 cm－1，掃描次數32次，掃描范圍4 000～10 000 cm－1，每次掃描前搖蕩樣品杯，每個樣品重復裝樣并掃描3次，同時獲取平均值圖譜。20批全方、15批缺棗仁方、15批缺珍珠母方共50批的200條NIRS圖疊加圖見圖4。

圖4 棗仁寧神膠囊近紅外光譜疊加圖

（2）NIRS模型的建立及驗證 在TQ analyst光譜分析軟件中導入已采集好的200條光譜，按4∶1的比例分配定標集和驗證集，對選中光譜進行波長選擇、標準化處理和微分計算，建立相應的數學模型，并進行模型內驗證。最終確定的模型數據為：Constant預處理，檢測波長范圍為4 000～10 000 cm－1全譜。模型驗證，準確度依次為：是否缺酸棗仁100.0%，是否缺珍珠母97.5%。

3 討論

本研究運用色譜結合光譜技術建立棗仁寧神膠囊質量控制方法，首先通過建立特征圖譜，發現有13個共有峰，其中可指認的有5個成分，分別為丹參素鈉、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、大黃素，并按照平均值的80%確定各成分的含量下限，依次為0.145 5%、0.024 5%、0.018 1%、0.042 8%、0.002 1%，結合特征圖譜中未能指認的共有峰對處方中的整體成分進行有效把控。大黃素為首烏藤檢測成分，首烏藤可養血安神、祛風通絡；丹參素鈉為丹參指標成分，丹參可行氣活血、清心除煩以安神；芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素為甘草指標成分，甘草能健脾益氣、調和諸藥。上述藥物與其他藥物配伍，可養心安神、健脾養血、疏肝解郁、調暢情志。

棗仁寧神膠囊重用炒酸棗仁為君藥，酸棗仁可收斂生津、滋補肝膽、寧心安神，適用于治療虛煩難以入眠、驚悸多夢等病證，珍珠母可定肝潛陽、定驚安神，與酸棗仁配伍，可加強養心安神之效。酸棗仁皂苷A 和B均為脂溶性成分，在棗仁寧神膠囊生產過程中轉移率較低，無法用HPLC有效檢測；珍珠母為動物類藥，其成分無法用TLC和HPLC有效檢測，或檢測結果沒有專屬性。因此本研究采用NIRS對2種藥味建立快速定性檢測模型，以檢測制劑中是否含有這兩種藥材，結果顯示準確率依次為100.0%和97.5%，但對其定量檢測仍需進一步建立檢測模型。