基于差異表達基因探討絕經后骨質疏松癥潛在靶點與機制

穆勝凱 崔晏君 郝連升 王騰騰 劉 君

1.山東省聊城市中醫醫院骨科，山東聊城 252000；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院針灸科，上海 200030；3.山東中醫藥大學附屬醫院老年醫學中心，山東濟南 250000

絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種以絕經后女性雌激素迅速降低引起的骨量和骨強度降低為主要特征的慢性病[1]。我國＞50 歲人群中骨質疏松癥（osteoporosis，OP）患病率為19.2%，其中女性為32.1%，明顯高于歐美國家[2]。40%～50%的OP 患者會并發病理性骨折，既影響其健康和生活質量，又造成了沉重的社會經濟負擔，故探明其發病機制并進行有效干預非常重要[3-4]。

骨代謝的動態平衡由成骨細胞與破骨細胞的骨形成、骨吸收作用共同維持，影響兩者分化、功能的因素都可破壞骨骼微環境穩態[5]。女性絕經后雌激素水平下降會通過各種信號通路引起骨代謝失衡及骨量減少，導致PMOP，相關通路涉及核因子κB 受體活化因子配體通路、絲裂原活化蛋白激酶通路、Notch 信號通路等[6-10]。目前抗OP 藥物如雙膦酸鹽類等雖可有效抑制骨吸收，但長期應用可致骨小梁重塑不良、骨形成抑制，且費用高昂[11]。因此，探索PMOP 新的發病機制非常必要，可為靶向新藥研發提供更精準的靶點，以提高臨床療效。本研究擬通過基因表達數據庫獲得PMOP 的相關芯片數據，從中篩選出差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）后進行富集分析，為進一步研究PMOP 發病機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 一般資料

從基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取基因表達譜芯片數據集GSE56116[12]。該數據集截至2018 年2 月22 日包含13 例來自兩組不同人群（3 例來自絕經后骨質健康的女性，10 例來自PMOP 的女性）的樣本。

1.2 獲取DEGs

使用在線分析軟件GEO2R 對芯片原始數據進行差異表達分析，并用微生信平臺繪制DEGs 火山圖；設P＜0.05、|logFC|≥1，獲得GSE56116 的DEGs，使用UniProt 數據庫進行規范、驗證后用微生信平臺繪制PMOP 的DEGs 熱圖[13]。

1.3 蛋白質-蛋白質相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網絡與網絡拓撲分析

把“1.2”所得DEGs 導入STRING 在線數據庫（https：//string-db.org/），借助Cytoscape 3.9.1 構建DEGs的PPI 網絡并進行拓撲分析，據degree 值篩選出相互作用密切的核心基因，核心模塊通過MCODE 插件分析[14-15]。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析

將篩選后的DEGs 導入clusterProfiler，pathview等R 包，分別對GO 功能的“分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）、細胞成分（cell component，CC）”及KEGG 通路進行富集分析[16-17]。使用微生信平臺進行可視化處理。

2 結果

2.1 DEGs

GSE56116 基因表達譜芯片的DEGs 火山圖見圖1。共得到656 個差異基因，其中下調基因421 個，上調基因235 個。DEGs 的聚類熱圖見圖2，紅色、藍色分別表示基因表達量的增加、減少，其深淺代表增減的程度。

圖1 GSE56116 的差異表達基因火山圖

圖2 GSE56116 的差異表達基因聚類熱圖

2.2 PPI 構建及分析

656 個DEGs 的PPI 網絡見圖3，包含了614 個節點及1 368 條邊，對PPI 網絡進行網絡拓撲分析得到10 個核心基因，即VEGFA、KRAS、EP300、IL-2、IL-4、KIT、FOS、CCND1、HGF、CYCS，使用MCODE 插件分析PPI 網絡的核心模塊，Score 值最大的核心模塊見圖4。

圖3 差異基因的蛋白質-蛋白質相互作用網絡

圖4 MCODE 插件分析確認的網絡核心模塊

2.3 DEGs 富集分析

GO 中MF、BP、CC 富集結果分別為771、4 648、499 個；KEGG 通路富集結果299 條。MF 主要富集在脂肽結合、磷脂結合、蛋白激酶B 結合等，BP 主要富集在肽酶活性調節、蛋白水解作用負性調節、內肽酶活性調節等，CC 主要富集在內質囊泡，等離子膜外側等（圖5）。KEGG 通路分析主要涉及PI3K-Akt 信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體相互作用、B細胞受體信號通路、Ras 信號通路等（圖6）。其中PI3K-Akt 信號通路（圖7）為核心基因顯著富集的信號通路。

圖5 基因本體功能富集分析

圖6 京都基因和基因組數據庫通路富集分析

圖7 PI3K-Akt 信號通路

3 討論

目前，PMOP 的發病機制尚未完全明確，研究表明其發病與特定基因的表達有關[18]。本研究篩選出的核心基因有VEGFA、KRAS、EP300、IL-2、IL-4 等。VEGF（vascular endothelial growth factor，VEGF）與OP 發病關系密切[19]。VEGF 既可增加成骨細胞的成骨作用又能降低破骨細胞的骨吸收作用，加速骨的形成與重建，在OP 的病理生理過程中起著非常重要的作用[20]。骨髓間充質干細胞的成骨與成脂穩態失衡在OP 的發病中起關鍵作用[21]；KRAS 的表達有利于骨髓間充質干細胞向成骨分化[22]。TGF-β1/Smad4 信號通路在調節骨髓微環境平衡中起著非常重要的作用，是PMOP 發生、發展的重要機制之一[23]。EP300 是Smad4 的轉錄共激活因子，在該信號通路的正常傳導與功能發揮中起到重要作用[24]。白細胞介素（interleukin，IL）-2 是與骨代謝密切相關的細胞因子，其水平與成骨細胞的活性呈正相關[25-28]。IL-4 能抑制破骨細胞形成并減弱其骨吸收作用[29-30]。

在本研究中，KEGG 富集通路中含核心基因最多的通路是PI3K-Akt 信號通路，包含了23 個DEGs，其中VEGFA、KRAS、IL-2、IL-4、KIT、CCND1、HGF 為核心基因，說明PI3K-Akt 通路可能與PMOP 關系密切。PI3K-Akt 通路被激活可引起成骨分化標志物——促堿性磷酸酶、BMP-2 等很多與骨組織有關的分子表達發生變化，促進成骨細胞分化與增殖[31]。PI3K-Akt通路被抑制可減弱破骨細胞骨吸收能力，因此，PI3KAkt 通路對成骨細胞與破骨細胞的調節可能具有雙重作用[32]。有研究證實，PI3K-Akt 通路在調控成骨與破骨細胞增殖與功能中極為重要，對骨代謝及其平衡的維持作用巨大[33]。雌激素在PI3K-Akt 通路信號傳導中起積極作用，絕經后女性雌激素水平急劇降低，PI3K-Akt 通路激活受限，可能是PMOP 的發病機制之一[34]。此外，KEGG 富集通路多與免疫有關，如B 細胞受體信號通路等，B 淋巴細胞是在雌激素缺乏條件下形成破骨細胞的主要調節因子，且成骨和破骨細胞可與各種免疫細胞通過旁分泌機制或直接接觸產生相互作用，說明絕經后女性免疫狀態的變化與PMOP 的發生息息相關[35]。

綜上所述，本研究分析所得到的核心基因和信號通路可為PMOP 的靶點與機制研究、新藥研發提供新的思路與方法。但是，本研究所得到的結論尚處于理論階段且樣本量偏小，尚需基礎實驗來進一步驗證其科學性。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。